紊亂的血流經(jīng)Frizzled-4-β-catenin依賴性通路增加內(nèi)皮炎癥和通透性

Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway

Keywords: Mechanotransduction, Inflammation, Orbital shaker, Atherosclerosis, Adherens junctions, Cytoskeleton

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內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)受血流產(chǎn)生的壁剪切應(yīng)力影響，其表面機械傳感器通過機械信號通路響應(yīng)這種應(yīng)力。血管局部結(jié)構(gòu)（如直形無分支區(qū)域與彎曲、分叉區(qū)域）決定了剪切應(yīng)力的特性，進而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能差異。無分支區(qū)域與彎曲的高幅度、搏動性單軸剪切應(yīng)力可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，激活保護通路并促進相關(guān)蛋白表達。分叉區(qū)域則易引發(fā)內(nèi)皮功能障礙，表現(xiàn)為通透性增加、eNOS 表達減少及促炎通路激活，與動脈粥樣硬化易發(fā)性相關(guān)。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為低時間平均壁剪切應(yīng)力和高振蕩剪切指數(shù)是引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵，而近期研究更強調(diào)紊亂流或多向流的作用。雖然已知部分信號通路與流依賴性內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)，但紊亂流影響內(nèi)皮細(xì)胞行為的具體機制仍不清楚。Wnt 信號通路不僅調(diào)控非血管機械響應(yīng)細(xì)胞對機械力的反應(yīng)，其在血管細(xì)胞中的作用也逐步明確。非經(jīng)典 Wnt 配體參與血流依賴的內(nèi)皮細(xì)胞極化，而在致動脈粥樣硬化的血流環(huán)境中，Wnt 通路基因呈現(xiàn)富集狀態(tài)，這提示該通路或許與血流介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能異常存在關(guān)聯(lián)，且振蕩剪切應(yīng)力可通過增強 β- 連環(huán)蛋白信號激活 NF-κB。經(jīng)典 Wnt 信號通路依賴 β- 連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化及核轉(zhuǎn)運調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，其機制因多種配體、受體的組合作用而復(fù)雜。

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基于此，倫敦帝國理工學(xué)院生物工程系的研究團隊借助可模擬紊亂多向流的體外模型，探究了經(jīng)典 Wnt 信號通路在內(nèi)皮細(xì)胞對紊亂流的響應(yīng)及功能障礙中的作用。研究成果發(fā)表在Journal of Cell Science期刊，題為“Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway”。

首先，由于之前有研究表明，F(xiàn)rizzled-4（FZD4）的 mRNA 水平對血流條件敏感，研究人員在不同血流條件下評估了FZD4 的表達水平。結(jié)果表明，與正常流和靜態(tài)條件相比，紊亂流處理 24 小時可顯著上調(diào) FZD4 蛋白表達，且該效應(yīng)能持續(xù)至 72 小時（圖 1A），而正常流與靜態(tài)條件下的 FZD4 表達無明顯差異（圖 1B）。此外，在生理狀態(tài)下，豬主動脈弓內(nèi)側(cè)彎曲這一長期受紊亂流影響的區(qū)域，其 FZD4 表達也高于外側(cè)彎曲的正常流區(qū)域（圖 1C）。進一步支持了紊亂流對 FZD4 表達的調(diào)控作用，且提示該調(diào)控可能與內(nèi)皮炎癥信號傳導(dǎo)相關(guān)。

為了探究 FZD4 是否介導(dǎo)長期紊亂流下的內(nèi)皮功能障礙，研究人員通過 siRNA 敲低 FZD4進行了研究。發(fā)現(xiàn)紊亂流條件下，F(xiàn)ZD4 敲低可顯著降低促炎基因（SELE、MCP-1、VCAM1）的表達（圖 1D），VCAM1 蛋白的表達也有所減少（圖 1E）。而該效應(yīng)僅存在于紊亂流環(huán)境中，在正常流下促炎基因本底表達較低，且不受 FZD4 敲低影響。這表明 FZD4 在紊亂流誘導(dǎo)的內(nèi)皮促炎反應(yīng)中起特異性介導(dǎo)作用。

圖1   在受到紊亂血流刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，F(xiàn)ZD4 的表達水平升高，并且其可調(diào)控促炎信號傳導(dǎo)。

接著，研究人員進一步探究了紊亂流上調(diào) FZD4 蛋白的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紊亂流下 FZD4 基因表達低于正常流（圖 2A），這提示其調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后或翻譯后水平。在紊亂流和正常流條件下 ，ZNRF3 的表達水平無明顯差異（圖 2B），但紊亂流可顯著上調(diào) RSPO-3 （一種可抑制 ZNRF3 的蛋白）的基因（圖 2C）和蛋白表達（圖 2D）（其他 RSPO 家族成員未檢測到），而 RSPO-3 可抑制 ZNRF3 介導(dǎo)的 FZD4 溶酶體降解。實驗證實，敲低 RSPO-3 會使紊亂流下的 FZD4 蛋白表達顯著降低（圖 2E、F），且會減少促炎基因 SELE 和 VCAM1 的表達（圖 2G），與敲低 FZD4 的效應(yīng)一致。這些數(shù)據(jù)表明，紊亂流下 FZD4 的表達受 RSPO-3 調(diào)控。

圖2   在受到紊亂血流刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，RSPO-3 的表達水平升高，并且其可調(diào)控 FZD4 的表達。

已知 FZD4 可激活依賴 β- 連環(huán)蛋白的經(jīng)典 Wnt 通路，低剪切應(yīng)力、振蕩剪切應(yīng)力或致動脈粥樣硬化剪切應(yīng)力可激活 β- 連環(huán)蛋白，但紊亂流是否具有相同效應(yīng)尚不明確。為了驗證 β- 連環(huán)蛋白在紊亂流下的作用，研究人員使用 iCRT5 抑制 β- 連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄活性（圖 3A），發(fā)現(xiàn)其可特異性降低紊亂流下促炎基因（SELE、MCP-1、VCAM1）的表達（圖 3B），減少單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附（圖 3D），且對正常流條件無影響。此外，iCRT5 還能減弱 TNFα 誘導(dǎo)的促炎基因上調(diào)（圖 3C）。這些結(jié)果表明，β- 連環(huán)蛋白在易致動脈粥樣硬化血流引發(fā)的炎癥激活中起調(diào)控作用，其效應(yīng)與敲低 FZD4 或 RSPO-3 一致。

接下來，實驗進一步證實 FZD4 與 β- 連環(huán)蛋白的關(guān)聯(lián)。敲低 FZD4 會使紊亂流下 β- 連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低（圖 3E）、蛋白水平下降（圖 3F），而轉(zhuǎn)錄本水平不受影響（圖 3G），且該效應(yīng)僅存在于紊亂流環(huán)境。同時，敲低 RSPO-3 也會減少紊亂流下 β- 連環(huán)蛋白的表達（圖 3F）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)FZD4 依賴的 β- 連環(huán)蛋白激活至少在部分程度上介導(dǎo)了紊亂流的促炎效應(yīng)。  

圖3    在受到紊亂血流刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，β- 連環(huán)蛋白的活性增強，且這一過程依賴于 FZD4。

鑒于 Frizzled 受體常被 Wnt 配體激活，且 WNT5A 已知可促進內(nèi)皮細(xì)胞炎癥信號，研究人員探究了其在紊亂流響應(yīng)中的作用。紊亂流會使內(nèi)皮細(xì)胞中 WNT5A 的轉(zhuǎn)錄水平（圖 4A）和蛋白水平（圖 4B）表達顯著增加。用 WNT5A siRNA 轉(zhuǎn)染后，WNT5A 的表達降低了 35–40%（圖 4C），且 SELE、MCP-1 和 VCAM1 的表達也相應(yīng)減少（圖 4D）。這些數(shù)據(jù)表明，WNT5A 可在紊亂流條件下促進內(nèi)皮功能障礙。用 SFRP-1 阻斷 WNT5A 與 Frizzled 受體的相互作用，可降低 β- 連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性（圖 4E）。當(dāng)細(xì)胞暴露于 SFRP-1 達 72 小時時，可顯著降低 SELE 、MCP-1和VCAM1 的表達（圖 4F）。這些結(jié)果表明，抑制 WNT5A 信號可減少紊亂流依賴的 β- 連環(huán)蛋白激活并減弱炎癥信號。

圖4   在受到紊亂血流刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，WNT5A 的表達水平升高。

然后，研究進一步探究了 FZD4 信號的下游機制。紊亂流會增加內(nèi)皮細(xì)胞中 GSK3β 的 Ser9 磷酸化（該修飾可抑制 GSK3β，進而激活 β- 連環(huán)蛋白）（圖 5A），而敲低 FZD4 或 RSPO-3 會減少這種磷酸化（圖 5B），表明其通過影響 β- 連環(huán)蛋白降解復(fù)合體發(fā)揮作用。此外，用 IWR-1 穩(wěn)定降解復(fù)合體可抑制 β- 連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄活性，并減少SELE 和 MCP-1 的表達，與敲低 WNT5A、FZD4及抑制 β- 連環(huán)蛋白信號的效應(yīng)一致（圖 5C、D）。這些結(jié)果表明，紊亂流環(huán)境中，F(xiàn)ZD4 信號通過 GSK3β 調(diào)控經(jīng)典 Wnt 通路（依賴 β- 連環(huán)蛋白），進而影響內(nèi)皮細(xì)胞功能 。

為了進一步探究 FZD4 激活 β- 連環(huán)蛋白的通路依賴性，研究人員評估了 LRP6 的激活情況（LRP6 激活是經(jīng)典 Wnt 通路的標(biāo)志）。結(jié)果顯示，紊亂流與正常流條件下 LRP6 的磷酸化水平及總蛋白量無差異（圖 5E、F） ，且用 DKK-1 阻斷 LRP 與 Frizzled 受體的相互作用，對促炎基因表達（圖 5G）及單核細(xì)胞黏附無影響，表明 FZD4 激活 β- 連環(huán)蛋白不依賴 LRP6。同時發(fā)現(xiàn)，紊亂流會上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中 Ryk 的表達（圖 5H），敲低 Ryk 可減少紊亂流下 β- 連環(huán)蛋白的水平及 VCAM1 的表達（圖 5I-K），表明 Ryk 可能作為替代組分參與 FZD4 介導(dǎo)的 β- 連環(huán)蛋白調(diào)控及炎癥反應(yīng)。

圖5    紊亂血流可抑制 β- 連環(huán)蛋白降解復(fù)合體的功能，且這一過程依賴于 FZD4、RSPO-3 和 Ryk。

最后，由于抑制 β- 連環(huán)蛋白信號可改變紊亂流誘導(dǎo)的炎癥激活，研究人員進而探究這種抑制作用是否同樣會影響暴露于紊亂流的內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。使用 iCRT5 抑制 β- 連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄活性后，可以顯著降低紊亂流下 FITC - 親和素的通透性（圖 6A、B），對正常流無影響（圖 6B）。同時，iCRT5 可改善紊亂流導(dǎo)致的連接結(jié)構(gòu)紊亂，ZO-1 的表達增加，連接結(jié)構(gòu)更有序（圖 6C），并使細(xì)胞形態(tài)更規(guī)則（排列一致、更細(xì)長）（圖 6C-E）。這些結(jié)果表明，紊亂流會增加內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞旁通透性，而抑制 β- 連環(huán)蛋白活性可改善這一現(xiàn)象。

圖6     在受到紊亂血流刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，β- 連環(huán)蛋白的活性增強會增加細(xì)胞通透性，并改變細(xì)胞骨架及連接結(jié)構(gòu)的組織方式。

研究進一步探究了 β- 連環(huán)蛋白抑制對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。iCRT5 處理可減少紊亂流下內(nèi)皮細(xì)胞的應(yīng)力纖維數(shù)量，增加連接部皮質(zhì)肌動蛋白染色（與連接穩(wěn)定、通透性降低相關(guān)）（圖 6D），并使紐蛋白從粘著斑更多地定位到連接部周圍（圖 6E）。而敲低 FZD4 也會引發(fā)類似的細(xì)胞形態(tài)、連接結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架及紐蛋白定位變化（圖 7A-C）。敲低 WNT5A，會引發(fā)細(xì)胞形態(tài)（伸長）、細(xì)胞骨架（應(yīng)力纖維減少、皮質(zhì)肌動蛋白增加）及連接結(jié)構(gòu)變化（圖 7D）。同時，抑制 β- 連環(huán)蛋白信號通過上調(diào) PECAM-1、JAM-A、JAM-C（JAM3）、ZO-1（TJP1）和 CLDN5 的表達（圖 7E） ，穩(wěn)定細(xì)胞間連接，從而增強內(nèi)皮屏障功能。這些數(shù)據(jù)表明，抑制 β- 連環(huán)蛋白信號可增加紊亂流暴露的內(nèi)皮細(xì)胞中連接蛋白的表達并穩(wěn)定細(xì)胞間連接。

圖7    在受到紊亂血流刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，敲低 FZD4 或 WNT5A 會改變細(xì)胞骨架和紐蛋白的組織方式。

圖8    紊亂血流依賴性的 FZD4-β- 連環(huán)蛋白信號通路的推測機制。  

總之，該研究表明，紊亂流會通過上調(diào) RSPO-3 來增加 FZD4 的表達，F(xiàn)ZD4 進而不依賴 LRP 信號激活 β- 連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥激活和屏障功能破壞（圖 8）。這一通路的發(fā)現(xiàn)揭示了紊亂流誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙的新機制。

參考文獻：Rickman M, Ghim M, Pang K, von Huelsen Rocha AC, Drudi EM, Sureda-Vives M, Ayoub N, Tajadura-Ortega V, George SJ, Weinberg PD, Warboys CM. Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway. J Cell Sci. 2023 Mar 15;136(6):jcs260449. doi: 10.1242/jcs.260449. Epub 2023 Mar 24. PMID: 36846872; PMCID: PMC10112981.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36846872/

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