4種細菌計數分光光度計法的建立及應用
引言
在禽類養殖中，細菌性疾病是較常見且危害大的一類疫病。細菌性疾病常見的種類有20多種，其中具有代表性的細菌有大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、葡萄球菌、副雞嗜血桿菌等Ｗ。病原細菌的滋生和繁殖容易導致養殖動物的生長受阻、免疫力下降和疾病發生，對養殖業造成巨大的經濟損失。實驗室進行抗生素及替抗產品評估，均需要配制標準濃度的菌液，所以需要對細菌菌液的濃度進行測定。目前，細菌計數的常用方法有顯微計數法、麥氏比濁法、質量測定法和平板計數法等。常見的麥氏比濁法操作簡單，但容易受到操作者主觀因素的影響，誤差較大。顯微鏡計數法和平板計數法雖然結果相對于麥氏比濁法準確，但操作復雜、費時費力且重復性較差，對后續試驗的實施有一定影響。
在一定的濃度范圍內，菌懸液中的微生物細胞濃度與液體的吸光度成正比，與透光度成反比Ｍ。王曉旭等和董自艷等發現，不同細菌在一定濃度范圍內，菌懸液濃度與吸光度呈良好的線性關系。因此，可以通過測定菌懸液吸光度來確定微生物細胞的濃度。本研究以大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、葡萄球菌為目標菌，對不同濃度的細菌懸液進行平板計數與吸光度值測定，分析二者之間線性關系，建立一種通過分光光度計對細菌進行計數的方法。
1.材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種 標準菌株：大腸埃希菌25922、葡萄球菌25923；實驗室分離鑒定的菌株：沙門氏菌21106、鴨疫里默氏桿菌21119。
1.1.2試劑與儀器 LB液體培養基、營養瓊脂培養基、胎牛血清、無菌PBS溶液；UV－1900型分光光度計、恒溫振蕩培養箱、CO2培養箱。
1.2方法
1.2.1菌液制備 從－80°Ｃ冰箱取出保存的菌株，在含有5％牛血清的營養瓊脂板上進行劃線復蘇。待細菌過夜培養后，在無菌環境下，挑取純化后的單菌落接種于10mL含5％牛血清的LB液體培養基中，搖床振蕩培養12~18ｈ（37℃，200r/min），獲得細菌原液。將原液進行2倍梯度稀釋，共稀釋6個梯度。
1.2.2吸光度測定 取3mL梯度稀釋的菌液至比色皿中，在波長600ｎｍ處測定其吸光度值，盡可能保證其吸光度值在0.1~1.0之間，重復測定3次。
1.2.3平板計數 依次將不同濃度的菌懸液用液體培養基做10倍梯度稀釋。分別取10-5~10-8稀釋度的菌液各100µL點在營養瓊脂平板中，搖勻并做好標記。過夜培養后，記錄各平板上的菌落數，選取菌落數在30~300個之間的平板作為菌落總數測定的標準。
1.2.4標準曲線的建立 將不同濃度菌液測得的吸光度值作為橫坐標，平板計數所得活菌數（*10-7CFU/mL）為縱坐標，建立標準曲線。
1.2.5標準曲線的應用 不同菌種各選取兩株細菌，過夜培養后測定其吸光度值，然后通過平板菌落計數法測活菌濃度（步驟同1.2.3）。將測量所得吸光度值代人建立的標準曲線回歸方程，將計算得到的結果與實際平板計數結果進行對比驗證，計算其擬合程度。
2．結果
2.1細菌平板計數與吸光度值測定結果
將不同細菌不同稀釋度的吸光度：值與細菌平板計數得到結果，進行統計分析。每種細菌統計三組數據，將三組數據分別與平板計數的結果進行擬定線性方程，選擇線性關系較好的一組數據作為最終建立標準曲線的方程式。具體數據見表1。
2.2不同細菌的標準曲線的建立
根據對不同細菌菌懸液的吸光度值測定與平板計數(表1)，以測定所得吸光度值為橫坐標，細菌平板計數結果(x10?CFU/mL)為縱坐標，建立不同細菌的細菌數與吸光度值之間相關線性關系的標準曲線，如圖1~4.若建立的回歸方程R2大于0.95，表明在此吸光度范圍內細菌懸液的吸光度與細菌數量之間呈良好的線性關系
2.2.1大腸桿菌標準曲線 以大腸桿菌不同稀釋度利用分光光度計測得的吸光度值為橫坐標、活菌濃度為縱坐標建立大腸桿菌細菌數-吸光度標準曲線，其建立的回歸方程為y=132.53x-0.6058(R2=0.9937)，呈現良好的線性關系(圖1)。
2.2.2沙門氏菌標準曲線 以沙門氏菌不同稀釋度利用分光光度計測得的吸光度值為橫坐標、活菌濃度為縱坐標建立沙門氏菌細菌數-吸光度標準曲線，其建立的回歸方程為y=190.23x+8.1172(R2=0.9989)，呈現良好的線性關系(圖2)。
2.2.3葡萄球菌標準曲線 以葡萄球菌不同稀釋度利用分光光度計測得的吸光度值為橫坐標、活菌濃度為縱坐標建立葡萄球菌細菌數-吸光度標準曲線，其建立的回歸方程為y=287.61x+12.764(R2-0.9943)，呈現良好的線性關系(圖3)。
2.2.4鴨疫里默氏桿菌標準曲線 以鴨疫里默氏桿菌不同稀釋度利用分光光度計測得的吸光度值為橫坐標、活菌濃度為縱坐標建立鴨疫里默氏桿菌-吸光度標準曲線，其建立的回歸方程為y=103.17x-5.0077(R2=0.9942)，呈現良好的線性關系(圖4)。
2.3標準曲線的應用
不同菌種各選取兩株細菌進行平板計數與吸光度值測定并計算其擬合程度，結果顯示，大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌以及鴨疫里默氏桿菌菌懸液的實際細菌計數數值與曲線計算數值擬合程度均達到了90%以上，具有較高的可信度，推薦使用(表2)。
3.討論與結論
實驗室常規的細菌濃度檢測，一般采用平板計數的方法，該方法是細菌的活菌計數法，使用中容易受操作者的熟練程度和細菌的不同生長周期影響，并且需要人員眼觀計數，從而使計數的重復性差，并且操作過程費時費力。目前在實驗室進行藥物的最小抑菌濃度測定，藥敏試驗等試驗需要快速細菌計數，因此，與傳統計數方法相比，用細菌標準曲線進行細菌計數省時省力，操作便捷，重復性良好。細菌懸浮液的吸光度與菌液濃度之間呈正相關，通過測定菌液的吸光度，結合平板計數結果繪制出的標準曲線，可以相對準確快速地根據吸光度計算菌液濃度。在進行大量細菌的微量最小抑菌濃度的藥敏實驗時，可以根據所需的菌液濃度通過標準方程推出適合的吸光度，再根據所需吸光度對菌液進行稀釋，在很大程度上增加了實驗操作的便利性，也為實驗結果的準確性提供了保證。
本研究細菌計數方法的建立，簡便快捷，為實驗室建立不同細菌的標準曲線方程提供了參考。
文章來源：[1]許明清,汪建華,王振,等.4種細菌計數分光光度計法的建立及應用[J].山東畜牧獸醫,2024,45(06):8-10.
在禽類養殖中，細菌性疾病是較常見且危害大的一類疫病。細菌性疾病常見的種類有20多種，其中具有代表性的細菌有大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、葡萄球菌、副雞嗜血桿菌等Ｗ。病原細菌的滋生和繁殖容易導致養殖動物的生長受阻、免疫力下降和疾病發生，對養殖業造成巨大的經濟損失。實驗室進行抗生素及替抗產品評估，均需要配制標準濃度的菌液，所以需要對細菌菌液的濃度進行測定。目前，細菌計數的常用方法有顯微計數法、麥氏比濁法、質量測定法和平板計數法等。常見的麥氏比濁法操作簡單，但容易受到操作者主觀因素的影響，誤差較大。顯微鏡計數法和平板計數法雖然結果相對于麥氏比濁法準確，但操作復雜、費時費力且重復性較差，對后續試驗的實施有一定影響。
在一定的濃度范圍內，菌懸液中的微生物細胞濃度與液體的吸光度成正比，與透光度成反比Ｍ。王曉旭等和董自艷等發現，不同細菌在一定濃度范圍內，菌懸液濃度與吸光度呈良好的線性關系。因此，可以通過測定菌懸液吸光度來確定微生物細胞的濃度。本研究以大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、葡萄球菌為目標菌，對不同濃度的細菌懸液進行平板計數與吸光度值測定，分析二者之間線性關系，建立一種通過分光光度計對細菌進行計數的方法。
1.材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種 標準菌株：大腸埃希菌25922、葡萄球菌25923；實驗室分離鑒定的菌株：沙門氏菌21106、鴨疫里默氏桿菌21119。
1.1.2試劑與儀器 LB液體培養基、營養瓊脂培養基、胎牛血清、無菌PBS溶液；UV－1900型分光光度計、恒溫振蕩培養箱、CO2培養箱。
1.2方法
1.2.1菌液制備 從－80°Ｃ冰箱取出保存的菌株，在含有5％牛血清的營養瓊脂板上進行劃線復蘇。待細菌過夜培養后，在無菌環境下，挑取純化后的單菌落接種于10mL含5％牛血清的LB液體培養基中，搖床振蕩培養12~18ｈ（37℃，200r/min），獲得細菌原液。將原液進行2倍梯度稀釋，共稀釋6個梯度。
1.2.2吸光度測定 取3mL梯度稀釋的菌液至比色皿中，在波長600ｎｍ處測定其吸光度值，盡可能保證其吸光度值在0.1~1.0之間，重復測定3次。
1.2.3平板計數 依次將不同濃度的菌懸液用液體培養基做10倍梯度稀釋。分別取10-5~10-8稀釋度的菌液各100µL點在營養瓊脂平板中，搖勻并做好標記。過夜培養后，記錄各平板上的菌落數，選取菌落數在30~300個之間的平板作為菌落總數測定的標準。
1.2.4標準曲線的建立 將不同濃度菌液測得的吸光度值作為橫坐標，平板計數所得活菌數（*10-7CFU/mL）為縱坐標，建立標準曲線。
1.2.5標準曲線的應用 不同菌種各選取兩株細菌，過夜培養后測定其吸光度值，然后通過平板菌落計數法測活菌濃度（步驟同1.2.3）。將測量所得吸光度值代人建立的標準曲線回歸方程，將計算得到的結果與實際平板計數結果進行對比驗證，計算其擬合程度。
2．結果
2.1細菌平板計數與吸光度值測定結果
將不同細菌不同稀釋度的吸光度：值與細菌平板計數得到結果，進行統計分析。每種細菌統計三組數據，將三組數據分別與平板計數的結果進行擬定線性方程，選擇線性關系較好的一組數據作為最終建立標準曲線的方程式。具體數據見表1。
2.2不同細菌的標準曲線的建立
根據對不同細菌菌懸液的吸光度值測定與平板計數(表1)，以測定所得吸光度值為橫坐標，細菌平板計數結果(x10?CFU/mL)為縱坐標，建立不同細菌的細菌數與吸光度值之間相關線性關系的標準曲線，如圖1~4.若建立的回歸方程R2大于0.95，表明在此吸光度范圍內細菌懸液的吸光度與細菌數量之間呈良好的線性關系
2.2.1大腸桿菌標準曲線 以大腸桿菌不同稀釋度利用分光光度計測得的吸光度值為橫坐標、活菌濃度為縱坐標建立大腸桿菌細菌數-吸光度標準曲線，其建立的回歸方程為y=132.53x-0.6058(R2=0.9937)，呈現良好的線性關系(圖1)。
2.2.2沙門氏菌標準曲線 以沙門氏菌不同稀釋度利用分光光度計測得的吸光度值為橫坐標、活菌濃度為縱坐標建立沙門氏菌細菌數-吸光度標準曲線，其建立的回歸方程為y=190.23x+8.1172(R2=0.9989)，呈現良好的線性關系(圖2)。
2.2.3葡萄球菌標準曲線 以葡萄球菌不同稀釋度利用分光光度計測得的吸光度值為橫坐標、活菌濃度為縱坐標建立葡萄球菌細菌數-吸光度標準曲線，其建立的回歸方程為y=287.61x+12.764(R2-0.9943)，呈現良好的線性關系(圖3)。
2.2.4鴨疫里默氏桿菌標準曲線 以鴨疫里默氏桿菌不同稀釋度利用分光光度計測得的吸光度值為橫坐標、活菌濃度為縱坐標建立鴨疫里默氏桿菌-吸光度標準曲線，其建立的回歸方程為y=103.17x-5.0077(R2=0.9942)，呈現良好的線性關系(圖4)。
2.3標準曲線的應用
不同菌種各選取兩株細菌進行平板計數與吸光度值測定并計算其擬合程度，結果顯示，大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌以及鴨疫里默氏桿菌菌懸液的實際細菌計數數值與曲線計算數值擬合程度均達到了90%以上，具有較高的可信度，推薦使用(表2)。
3.討論與結論
實驗室常規的細菌濃度檢測，一般采用平板計數的方法，該方法是細菌的活菌計數法，使用中容易受操作者的熟練程度和細菌的不同生長周期影響，并且需要人員眼觀計數，從而使計數的重復性差，并且操作過程費時費力。目前在實驗室進行藥物的最小抑菌濃度測定，藥敏試驗等試驗需要快速細菌計數，因此，與傳統計數方法相比，用細菌標準曲線進行細菌計數省時省力，操作便捷，重復性良好。細菌懸浮液的吸光度與菌液濃度之間呈正相關，通過測定菌液的吸光度，結合平板計數結果繪制出的標準曲線，可以相對準確快速地根據吸光度計算菌液濃度。在進行大量細菌的微量最小抑菌濃度的藥敏實驗時，可以根據所需的菌液濃度通過標準方程推出適合的吸光度，再根據所需吸光度對菌液進行稀釋，在很大程度上增加了實驗操作的便利性，也為實驗結果的準確性提供了保證。
本研究細菌計數方法的建立，簡便快捷，為實驗室建立不同細菌的標準曲線方程提供了參考。
文章來源：[1]許明清,汪建華,王振,等.4種細菌計數分光光度計法的建立及應用[J].山東畜牧獸醫,2024,45(06):8-10.
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