4種細(xì)菌計(jì)數(shù)分光光度計(jì)法的建立及應(yīng)用

引言
在禽類養(yǎng)殖中，細(xì)菌性疾病是較常見且危害大的一類疫病。細(xì)菌性疾病常見的種類有20多種，其中具有代表性的細(xì)菌有大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、葡萄球菌、副雞嗜血桿菌等Ｗ。病原細(xì)菌的滋生和繁殖容易導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物的生長受阻、免疫力下降和疾病發(fā)生，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗生素及替抗產(chǎn)品評估，均需要配制標(biāo)準(zhǔn)濃度的菌液，所以需要對細(xì)菌菌液的濃度進(jìn)行測定。目前，細(xì)菌計(jì)數(shù)的常用方法有顯微計(jì)數(shù)法、麥?zhǔn)媳葷岱ā①|(zhì)量測定法和平板計(jì)數(shù)法等。常見的麥?zhǔn)媳葷岱ú僮骱唵�，但容易受到操作者主觀因素的影響，誤差較大。顯微鏡計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法雖然結(jié)果相對于麥?zhǔn)媳葷岱��?zhǔn)確，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力且重復(fù)性較差，對后續(xù)試驗(yàn)的實(shí)施有一定影響。
在一定的濃度范圍內(nèi)，菌懸液中的微生物細(xì)胞濃度與液體的吸光度成正比，與透光度成反比Ｍ。王曉旭等和董自艷等發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)菌在一定濃度范圍內(nèi)，菌懸液濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。因此，可以通過測定菌懸液吸光度來確定微生物細(xì)胞的濃度。本研究以大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、葡萄球菌為目標(biāo)菌，對不同濃度的細(xì)菌懸液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)與吸光度值測定，分析二者之間線性關(guān)系，建立一種通過分光光度計(jì)對細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法。

1.材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種  標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌25922、葡萄球菌25923；實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的菌株：沙門氏菌21106、鴨疫里默氏桿菌21119。
1.1.2試劑與儀器  LB液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胎牛血清、無菌PBS溶液；UV－1900型分光光度計(jì)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、CO₂培養(yǎng)箱。

1.2方法
1.2.1菌液制備  從－80°Ｃ冰箱取出保存的菌株，在含有5％牛血清的營養(yǎng)瓊脂板上進(jìn)行劃線復(fù)蘇。待細(xì)菌過夜培養(yǎng)后，在無菌環(huán)境下，挑取純化后的單菌落接種于10mL含5％牛血清的LB液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)12~18ｈ（37℃，200r/min），獲得細(xì)菌原液。將原液進(jìn)行2倍梯度稀釋，共稀釋6個(gè)梯度。
1.2.2吸光度測定  取3mL梯度稀釋的菌液至比色皿中，在波長600ｎｍ處測定其吸光度值，盡可能保證其吸光度值在0.1~1.0之間，重復(fù)測定3次。
1.2.3平板計(jì)數(shù)  依次將不同濃度的菌懸液用液體培養(yǎng)基做10倍梯度稀釋。分別取10^-5~10^-8稀釋度的菌液各100µL點(diǎn)在營養(yǎng)瓊脂平板中，搖勻并做好標(biāo)記。過夜培養(yǎng)后，記錄各平板上的菌落數(shù)，選取菌落數(shù)在30~300個(gè)之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)。
1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立  將不同濃度菌液測得的吸光度值作為橫坐標(biāo)，平板計(jì)數(shù)所得活菌數(shù)（*10^-7CFU/mL）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的應(yīng)用  不同菌種各選取兩株細(xì)菌，過夜培養(yǎng)后測定其吸光度值，然后通過平板菌落計(jì)數(shù)法測活菌濃度（步驟同1.2.3）。將測量所得吸光度值代人建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，將計(jì)算得到的結(jié)果與實(shí)際平板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證，計(jì)算其擬合程度。

2．結(jié)果
2.1細(xì)菌平板計(jì)數(shù)與吸光度值測定結(jié)果
將不同細(xì)菌不同稀釋度的吸光度：值與細(xì)菌平板計(jì)數(shù)得到結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每種細(xì)菌統(tǒng)計(jì)三組數(shù)據(jù)，將三組數(shù)據(jù)分別與平板計(jì)數(shù)的結(jié)果進(jìn)行擬定線性方程，選擇線性關(guān)系較好的一組數(shù)據(jù)作為最終建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式。具體數(shù)據(jù)見表1。


2.2不同細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
根據(jù)對不同細(xì)菌菌懸液的吸光度值測定與平板計(jì)數(shù)(表1)，以測定所得吸光度值為橫坐標(biāo)，細(xì)菌平板計(jì)數(shù)結(jié)果(x10?CFU/mL)為縱坐標(biāo)，建立不同細(xì)菌的細(xì)菌數(shù)與吸光度值之間相關(guān)線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1~4.若建立的回歸方程R2大于0.95，表明在此吸光度范圍內(nèi)細(xì)菌懸液的吸光度與細(xì)菌數(shù)量之間呈良好的線性關(guān)系
2.2.1大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線  以大腸桿菌不同稀釋度利用分光光度計(jì)測得的吸光度值為橫坐標(biāo)、活菌濃度為縱坐標(biāo)建立大腸桿菌細(xì)菌數(shù)-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，其建立的回歸方程為y=132.53x-0.6058(R2=0.9937)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖1)。

2.2.2沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)曲線  以沙門氏菌不同稀釋度利用分光光度計(jì)測得的吸光度值為橫坐標(biāo)、活菌濃度為縱坐標(biāo)建立沙門氏菌細(xì)菌數(shù)-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，其建立的回歸方程為y=190.23x+8.1172(R2=0.9989)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2)。

2.2.3葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)曲線  以葡萄球菌不同稀釋度利用分光光度計(jì)測得的吸光度值為橫坐標(biāo)、活菌濃度為縱坐標(biāo)建立葡萄球菌細(xì)菌數(shù)-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，其建立的回歸方程為y=287.61x+12.764(R2-0.9943)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖3)。

2.2.4鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線  以鴨疫里默氏桿菌不同稀釋度利用分光光度計(jì)測得的吸光度值為橫坐標(biāo)、活菌濃度為縱坐標(biāo)建立鴨疫里默氏桿菌-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，其建立的回歸方程為y=103.17x-5.0077(R2=0.9942)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖4)。


2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的應(yīng)用
不同菌種各選取兩株細(xì)菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)與吸光度值測定并計(jì)算其擬合程度，結(jié)果顯示，大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌以及鴨疫里默氏桿菌菌懸液的實(shí)際細(xì)菌計(jì)數(shù)數(shù)值與曲線計(jì)算數(shù)值擬合程度均達(dá)到了90%以上，具有較高的可信度，推薦使用(表2)。


3.討論與結(jié)論
實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的細(xì)菌濃度檢測，一般采用平板計(jì)數(shù)的方法，該方法是細(xì)菌的活菌計(jì)數(shù)法，使用中容易受操作者的熟練程度和細(xì)菌的不同生長周期影響，并且需要人員眼觀計(jì)數(shù)，從而使計(jì)數(shù)的重復(fù)性差，并且操作過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥物的最小抑菌濃度測定，藥敏試驗(yàn)等試驗(yàn)需要快速細(xì)菌計(jì)數(shù)，因此，與傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法相比，用細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)省時(shí)省力，操作便捷，重復(fù)性良好。細(xì)菌懸浮液的吸光度與菌液濃度之間呈正相關(guān)，通過測定菌液的吸光度，結(jié)合平板計(jì)數(shù)結(jié)果繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以相對準(zhǔn)確快速地根據(jù)吸光度計(jì)算菌液濃度。在進(jìn)行大量細(xì)菌的微量最小抑菌濃度的藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以根據(jù)所需的菌液濃度通過標(biāo)準(zhǔn)方程推出適合的吸光度，再根據(jù)所需吸光度對菌液進(jìn)行稀釋，在很大程度上增加了實(shí)驗(yàn)操作的便利性，也為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了保證。
本研究細(xì)菌計(jì)數(shù)方法的建立，簡便快捷，為實(shí)驗(yàn)室建立不同細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程提供了參考。
文章來源：[1]許明清,汪建華,王振,等.4種細(xì)菌計(jì)數(shù)分光光度計(jì)法的建立及應(yīng)用[J].山東畜牧獸醫(yī),2024,45(06):8-10.