Innopsys激光共聚焦掃描儀助力結(jié)直腸癌靶點發(fā)現(xiàn)

結(jié)直腸癌（CRC）作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高死亡率的顯著特征。在腫瘤免疫微環(huán)境中，細胞因子參與腫瘤細胞與免疫細胞之間的異質(zhì)性相互作用，例如趨化因子CXCL3在多種人類癌癥中介導腫瘤細胞的分化、侵襲和遷移等過程促進腫瘤進展。另外，髓系來源抑制性細胞（MDSCs）是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要負向調(diào)控因子，通過分泌免疫抑制細胞因子、產(chǎn)生代謝產(chǎn)物等多種方式抑制 T 細胞和自然殺傷（NK）細胞的活性，促進腫瘤免疫逃逸。然而，腸道微生物群及其代謝物是否通過細胞因子、 MDSCs 的積累和功能來影響結(jié)直腸癌進展，相關研究較為有限，需要進行深入探索，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的科學依據(jù)和潛在干預靶點。

文章題目為“Gut microbial metabolite 4-hydroxybenzeneacetic acid drives colorectal cancer progression via accumulation of immunosuppressive PMN-MDSCs”于2025年4月發(fā)表在J Clin Invest雜志，作者來自于南方醫(yī)科大學趙亮、丁彥青教授團隊以及廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院王慧教授團隊。

首先作者對臨床樣本進行腸道菌群分析，收集了20例CRC 患者和20例健康對照（HC）的糞便樣本，通過糞便宏基因組測序，分析兩組腸道菌群的α多樣性（Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)）、β多樣性（主坐標分析 PCoA）及差異菌種（線性判別分析 LEfSe），發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的腸道微生物多樣性顯著降低，并且特定菌種如具核梭桿菌（F. nucleatum）和大腸桿菌（E. coli）顯著富集。

進一步培養(yǎng)人CRC細胞系（HCT116以及SW480），將細胞與 E.coli 或 F.nucleatum 共孵育，模擬腸道菌群與腫瘤細胞的相互作用，隨后使用人細胞因子芯片檢測80種不同的細胞因子和趨化因子。在芯片表面孵育共培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基，并加入生物素偶聯(lián)的抗細胞因子抗體，清洗后加入鏈霉親和素-熒光素（Streptavidin-Fluor）進行標記，最后使用法國Innopsys公司的 InnoScan激光共聚焦掃描儀（激發(fā)波長為 532nm）對芯片進行數(shù)據(jù)采集（如圖1D）。結(jié)果顯示：與對照組相比，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、生長調(diào)節(jié)致癌基因（GRO，包括 GROα、GROβ 和 GROγ）、單核細胞趨化蛋白- 1（MCP-1）、巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）以及趨化因子CCL20顯著升高。此外，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行驗證（圖1E、F、G），結(jié)果表明變化最為顯著的細胞因子為巨噬細胞炎癥蛋白MIP-3α（即 CCL20）和生長調(diào)節(jié)致癌基因GROγ（即 CXCL3）。

圖1：（A）采用 Chao1 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)對結(jié)直腸癌組（CRC 組，n=20）和健康對照組（HC 組，n=20）進行α多樣性分析。（B）在物種水平上對結(jié)直腸癌組（n=20）和健康對照組（n=20）進行主坐標分析（Principal Coordinate Analysis，PCoA）。（C）采用線性判別分析效應量法（discriminant analysis effect size，LEfSe）篩選結(jié)直腸癌組（n=20）與健康對照組（n=20）間的標志物種。藍色柱形和紅色柱形分別代表在結(jié)直腸癌組和健康對照組中富集的菌群標志物種。（D）采用人細胞因子抗體芯片檢測經(jīng)具核梭桿菌或大腸桿菌處理后的 HCT116 細胞條件培養(yǎng)基（CM）中炎癥因子的變化情況。方框內(nèi)顯示的是與免疫細胞趨化相關的差異細胞因子，方框下方為細胞因子芯片韋恩圖。（E、F）實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析顯示，結(jié)直腸癌細胞與具核梭桿菌、大腸桿菌共培養(yǎng) 6 小時后，細胞因子表達發(fā)生變化（n=3）。（G）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測結(jié)直腸癌細胞與大腸桿菌、具核梭桿菌共培養(yǎng)后 CCL20 和 CXCL3 的分泌情況（n=5）。*P < 0.05，**P < 0.005，***P < 0.0005。
 

隨后采用高分辨率氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對臨床樣本進行代謝物檢測分析（HRGC-MS），發(fā)現(xiàn)多個由失調(diào)菌群產(chǎn)生的差異代謝物，包括4-羥基苯乙酸（4-HPA），其能夠顯著上調(diào)結(jié)直腸癌細胞中CXCL3的表達。進一步研究表明，4-HPA通過激活JAK2/STAT3信號通路，增強STAT3磷酸化，并促進其結(jié)合到CXCL3啟動子區(qū)域，從而上調(diào)CXCL3的轉(zhuǎn)錄水平。

在動物實驗中，喂食4-HPA的小鼠表現(xiàn)出腫瘤內(nèi)PMN-MDSCs數(shù)量顯著增加，同時CD8+ T細胞功能受損。而給予綠原酸（CGA）處理后，可有效減少腸道菌群生成4-HPA，緩解免疫抑制狀態(tài)。在臨床晚期結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)4-HPA含量明顯升高，并且CXCL3表達與MDSCs標志物呈正相關，與CD8+ T細胞密度呈負相關。

圖2. 微生物代謝產(chǎn)物 4 - 羥基苯乙酸（4-HPA）介導結(jié)直腸癌（CRC）免疫抑制的示意圖。腸道微生物組以 4 - 羥基苯乙酸（4-HPA）為信使，調(diào)控結(jié)直腸癌細胞（CRC 細胞）中趨化因子 CXCL3 的水平，進而控制 CXCR2 陽性多形核髓系抑制細胞（CXCR2⁺ PMN-MDSCs）的聚集。聚集的多形核髓系抑制細胞（PMN-MDSCs）會抑制 CD8 陽性 T 細胞（CD8⁺ T 細胞）的抗腫瘤作用。
 

結(jié)論：作者揭示腸道微生物代謝產(chǎn)物4-HPA通過激活JAK2/STAT3信號通路，促進結(jié)直腸癌細胞分泌趨化因子CXCL3，從而招募免疫抑制性的多形核髓源性抑制細胞（PMN-MDSCs），抑制CD8T細胞的抗腫瘤活性，最終促進結(jié)直腸癌進展及免疫抑制微環(huán)境的形成（如上圖2）。

這項研究不僅深化了對腸道菌群與腫瘤免疫互作機制的理解，也為未來的精準免疫治療提供了潛在靶點。開發(fā)特異性抑制4-HPA生成的益生菌或小分子藥物以及靶向阻斷CXCL3與CXCR2之間的信號傳遞，可考慮納入現(xiàn)有的免疫治療策略，以提高治療療效、延長患者生存期。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40179015/

Innopsys 成立于1999年。總部位于法國，一直致力于生物醫(yī)學領域相關儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。Innoscan系列掃描儀，采用先進的共聚焦PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時進行多通道熒光檢測。不僅有效降低了熒光光漂白現(xiàn)象以及信號損失，還可以有效縮短掃描時間。在基因組和蛋白組表達，基因突變，SNP檢測，CGH，細菌病毒檢測，腫瘤特異性標志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應用。

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