affinity、avidity和functional avidity影響TCR-T抗腫瘤反應(yīng)的機(jī)制

文章來(lái)源公眾號(hào)：TCRshows           作者小小富minfu

數(shù)十年來(lái)，T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移已徹底改變了癌癥免疫治療。特別是TCR的基因工程在開發(fā)更精確和個(gè)性化的癌癥免疫療法方面取得了重要里程碑。然而，為了最大程度地發(fā)揮這一策略的優(yōu)勢(shì)，必須深入理解TCR affinity、avidity以及functional avidity在TCR及T細(xì)胞識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（TAA）過(guò)程中的作用，這對(duì)于持續(xù)改進(jìn)過(guò)繼性T細(xì)胞治療至關(guān)重要。除了TCR相關(guān)參數(shù)外，調(diào)控T細(xì)胞活化的其他關(guān)鍵因素還包括TCR共受體對(duì)TCR- pMHC穩(wěn)定性和TCR信號(hào)傳導(dǎo)的影響、腫瘤表位密度以及TCR工程化T細(xì)胞中TCR的表達(dá)水平。這里描述了決定TCR特異性和T細(xì)胞活化的關(guān)鍵因素，并探討了這些概念如何應(yīng)用于癌癥特異性TCR引導(dǎo)的T細(xì)胞重定向。

1、TCR親和力：affinity、avidity與functional avidity
從TIL到TCR及CAR T細(xì)胞工程，T細(xì)胞在癌癥免疫治療的發(fā)展中標(biāo)志著重要的里程碑。T細(xì)胞依靠其TCR，在MHC的背景下識(shí)別短肽表位。該受體屬于免疫球蛋白基因超家族，由兩個(gè)不同的α和β多肽鏈組成異源二聚體，存在于典型的αβ T細(xì)胞中。其胞外域參與抗原識(shí)別，包含可變區(qū)、恒定區(qū)以及一個(gè)含有二硫鍵的鉸鏈區(qū)，以穩(wěn)定TCR鏈間的相互作用。該結(jié)構(gòu)延伸至跨膜區(qū)和胞內(nèi)域，后者通過(guò)非共價(jià)方式與CD3γ、δ、ε和ζ蛋白結(jié)合，形成TCR-CD3復(fù)合物。當(dāng)TCR正確識(shí)別相應(yīng)的pMHC，包括MHC類型與CD4/CD8共受體之間的匹配時(shí)，TCR會(huì)發(fā)生一系列構(gòu)象變化，從而產(chǎn)生第一激活信號(hào)。調(diào)控這一pMHC識(shí)別及后續(xù)T細(xì)胞活化的三個(gè)關(guān)鍵TCR參數(shù)是：TCR affinity、avidity和functional avidity（圖1）。TCR affinity是控制T細(xì)胞對(duì)抗原敏感性的關(guān)鍵因素，定義為單個(gè)TCR與pMHC配體之間相互作用的強(qiáng)度。它通常由結(jié)合速率（kon）和解離速率（koff）決定，并以平衡解離常數(shù)（KD）表示。如果TCR affinity涉及單個(gè)受體，那么TCR avidity則衡量多個(gè)TCR-pMHC結(jié)合的強(qiáng)度，并考慮其他分子（如TCR共受體）在相互作用中的影響，而functional avidity則代表T細(xì)胞在不同肽表位濃度下的適應(yīng)性和活性。平均functional avidity通常以EC50濃度表示，即達(dá)到T細(xì)胞群體半數(shù)最大激活所需的肽劑量。盡管生理?xiàng)l件下的TCR affinity范圍可從1µM到100µM，但多項(xiàng)研究指出，包括抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)在內(nèi)的T細(xì)胞最大活性的親和力閾值為5–10µM的肽表位。在一項(xiàng)對(duì)天然TCR與TCR-like CAR的比較研究中，發(fā)現(xiàn)TCR-like CAR中抗體片段的親和力是實(shí)現(xiàn)更優(yōu)T細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵因素。在此研究中，TCR affinity無(wú)法提升至5µM以上，而TCR-like CAR則表現(xiàn)出在nM范圍內(nèi)的更高親和力閾值。相反，一項(xiàng)傳統(tǒng)高親和力單鏈TCR與TCR-like CAR的比較顯示，盡管TCR-like CAR的表達(dá)水平更高，但其識(shí)別配體的敏感性較低，這可能與其信號(hào)動(dòng)力學(xué)有關(guān)。在一組針對(duì)NY-ESO-1且親和力增強(qiáng)但仍處于生理范圍內(nèi)的TCR中，經(jīng)TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞能夠?qū)Ω哂?µM的親和力產(chǎn)生響應(yīng)，表明親和力可能限制T細(xì)胞的最大激活。這一現(xiàn)象很可能是由于超過(guò)閾值后TCR affinity對(duì)TCR avidity的貢獻(xiàn)減少所致。此外，基于12種TCR-pMHC相互作用表型模型的計(jì)算分析表明，TCR affinity可能并非T細(xì)胞反應(yīng)的可靠指標(biāo)。

●圖1 TCR與pMHC之間的相互作用。T細(xì)胞通過(guò)pMHC識(shí)別腫瘤肽表位。多個(gè)參數(shù)會(huì)影響T細(xì)胞（包括經(jīng)TCR工程改造的T細(xì)胞）對(duì)pMHC的敏感性。TCR affinity描述的是單個(gè)TCR與pMHC之間相互作用的強(qiáng)度，通常使用SPR技術(shù)進(jìn)行測(cè)量。而TCR avidity則反映的是多個(gè)TCR與多個(gè)pMHC之間的整體結(jié)合情況。因此，常使用由多個(gè)通過(guò)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物連接并標(biāo)記熒光染料的pMHC組成的多聚體來(lái)染色抗原特異性T細(xì)胞，并測(cè)定其TCR avidity。該參數(shù)還考慮了T細(xì)胞共受體（如CD8）在穩(wěn)定TCR-pMHC結(jié)合中的作用。與TCR avidity密切相關(guān)的是functional avidity，它體現(xiàn)T細(xì)胞針對(duì)靶抗原的應(yīng)答能力，表現(xiàn)為T細(xì)胞的活化和效應(yīng)功能，包括T細(xì)胞增殖、抗腫瘤細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子分泌、活化標(biāo)志物上調(diào)等。

TCR的特異性是在一個(gè)成熟過(guò)程中獲得的，該過(guò)程基于可變區(qū)（V）、連接區(qū)（J）以及僅在β鏈中存在的多樣性（D）TCR片段的體細(xì)胞重排。這些重排產(chǎn)生近乎無(wú)限多樣的具有不同特異性的TCR庫(kù)，其中包括識(shí)別自身抗原的TCR，即人體內(nèi)天然表達(dá)的抗原。在過(guò)繼性T細(xì)胞治療中靶向的許多TAAs都是可在健康組織中同樣存在的自身抗原。由于針對(duì)自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的陰性選擇機(jī)制，對(duì)自身抗原有高親和力的T細(xì)胞克隆通常會(huì)被清除。因此，在循環(huán)T細(xì)胞中針對(duì)TAAs的高親和力TCR頻率較低。事實(shí)上，天然的癌癥特異性TCR通常難以對(duì)生理水平的表位密度產(chǎn)生有效的T細(xì)胞應(yīng)答，這也解釋了為何腫瘤能夠逃避T細(xì)胞的識(shí)別。相反，具有更高親和力以及更長(zhǎng)TCR-pMHC結(jié)合動(dòng)力學(xué)半衰期的TCR通常能引發(fā)更強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答，因?yàn)樗鼈兛梢愿兄�更低濃度的肽類表�?/span>。由于T細(xì)胞庫(kù)經(jīng)過(guò)編輯，循環(huán)T細(xì)胞對(duì)自身TAAs的親和力通常較低，因此體外親和力成熟成為增強(qiáng)T細(xì)胞識(shí)別低劑量肽表位能力的有效手段，甚至可使親和力提高達(dá)700倍。然而需要強(qiáng)調(diào)的是，親和力成熟并不總能解決低表位密度無(wú)法被識(shí)別的問(wèn)題，已有研究表明，經(jīng)過(guò)親和力成熟且具有極高親和力的TCR雖能加快T細(xì)胞的反應(yīng)速度，卻可能無(wú)法響應(yīng)低密度的pMHC。這種識(shí)別缺失可通過(guò)降低TCR親和力來(lái)恢復(fù)，使得結(jié)合半衰期超過(guò)10秒；但若半衰期達(dá)到10²至10³秒范圍，則會(huì)導(dǎo)致敏感性喪失。在一項(xiàng)研究中，分析了使用不同肽段疫苗接種后，一組低親和力與高親和力癌癥特異性T細(xì)胞克隆庫(kù)的koff速率，發(fā)現(xiàn)解離速率與靶標(biāo)識(shí)別及Ca2+動(dòng)員密切相關(guān)。更重要的是，疫苗所用肽段的親和力顯著影響接種后患者體內(nèi)產(chǎn)生的T細(xì)胞克隆的avidity，其中天然肽段和低親和力肽段更有利于誘導(dǎo)出更高avidity的癌癥特異性T細(xì)胞。

2、表位密度的作用
T細(xì)胞的活化依賴于TCR-pMHC結(jié)合動(dòng)力學(xué)，而這一過(guò)程又受到腫瘤細(xì)胞或APC膜上表位密度的影響。TAAs在細(xì)胞內(nèi)被加工處理后，與MHC分子結(jié)合形成pMHC，并呈現(xiàn)在細(xì)胞膜表面。腫瘤肽段與MHC分子之間的結(jié)合親和力已被證實(shí)與T細(xì)胞的應(yīng)答方式密切相關(guān)。研究表明，要實(shí)現(xiàn)腫瘤消退，p-MHC的親和力通常需達(dá)到10nM或更高。然而，由于抗原加工和呈遞機(jī)制存在缺陷，例如HLA分子水平下調(diào)，腫瘤肽抗原通常僅以少量形式表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面。在許多情況下，TAA水平通過(guò)基于mRNA的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，這可能無(wú)法準(zhǔn)確反映T細(xì)胞實(shí)際可接觸的pMHC數(shù)量。在對(duì)預(yù)測(cè)的可變剪接形式進(jìn)行肽組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，相較于正常轉(zhuǎn)錄本，癌癥特異性剪接變異體中過(guò)量存在的肽段僅占HLA I類表位的一小部分。此外，研究發(fā)現(xiàn)癌組織來(lái)源的轉(zhuǎn)錄本中含有更多的親水性氨基酸，這或許可以解釋為何癌癥特異性肽段較難被預(yù)測(cè)為MHC表位。一些研究嘗試?yán)�用針�?duì)NY-ESO-1和LAGE-1、過(guò)表達(dá)TAAs或分化相關(guān)TAAs的優(yōu)勢(shì)表位的高親和力可溶性TCR，來(lái)探究腫瘤細(xì)胞的免疫原性特征及其與表位密度的關(guān)系。該技術(shù)顯示，天然加工的TAA肽表位通常以每個(gè)細(xì)胞10至150個(gè)拷貝的數(shù)量呈現(xiàn)。這一數(shù)量足以激活抗原特異性T細(xì)胞，因?yàn)橐延醒芯孔C明，單個(gè)TCR-pMHC相互作用即可誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞的活化。該pMHC可連續(xù)與不同的TCR分子結(jié)合，在與約200個(gè)TCR結(jié)合后觸發(fā)T細(xì)胞活化。此外，僅需3個(gè)pMHC復(fù)合物就足以促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷作用。然而，最近的研究將正確激活T細(xì)胞所需的pMHC配體數(shù)量提高到了至少90個(gè)。

盡管TCR affinity與T細(xì)胞感知較低抗原密度的能力直接相關(guān)，但TCR（功能）avidity更能預(yù)測(cè)當(dāng)pMHC數(shù)量較少時(shí)，經(jīng)TCR改造的T細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤特異性反應(yīng)的能力。一些證據(jù)表明，在引發(fā)癌癥特異性T細(xì)胞反應(yīng)中，表位密度可能比TCR affinity或avidity起著更重要的作用。在非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型中，研究人員觀察到avidity在消除腫瘤負(fù)荷方面并未發(fā)揮主要作用。高親和力和低親和力的TCR均能成功清除小腫瘤，但都無(wú)法應(yīng)對(duì)較大的腫瘤。重要的是，高親和力T細(xì)胞的數(shù)量較之低親和力T細(xì)胞有所減少，很可能是因?yàn)榍罢吒�容易被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡。通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤側(cè)的表位密度以降低avidity，可恢復(fù)T細(xì)胞的適應(yīng)性。在針對(duì)內(nèi)源性黑色素瘤抗原TRP1的研究中也描述了類似現(xiàn)象。另一項(xiàng)報(bào)告則認(rèn)為，在體內(nèi)清除白血病細(xì)胞的主要因素是avidity，而非表位密度、p-MHC親和力或pMHC的穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)支持存在一個(gè)affinity和avidity的閾值，超過(guò)該閾值后，進(jìn)一步提高親和力或選擇超生理水平的avidity T細(xì)胞克隆，并不會(huì)轉(zhuǎn)化為更強(qiáng)的體內(nèi)反應(yīng)。因此，這挑戰(zhàn)了目前用于臨床前和臨床測(cè)試的T細(xì)胞克隆及TCR的選擇方式。然而，一項(xiàng)研究指出，針對(duì)白血病抗原WT1的高avidity TCR無(wú)法識(shí)別自然加工的WT1肽段。這些相互矛盾的研究凸顯了在癌癥識(shí)別背景下TCR-pMHC相互作用的復(fù)雜性，也揭示了僅依據(jù)最佳TCR affinity或avidity來(lái)篩選用于TCR工程化的T細(xì)胞克隆或TCR所存在的風(fēng)險(xiǎn)。

3、TCR共受體的作用
TCR與相應(yīng)的pMHC結(jié)合后，TCR共受體CD4和CD8分別與MHC II類和I類分子的恒定區(qū)結(jié)合。通常認(rèn)為，這些共受體通過(guò)兩種主要效應(yīng)增強(qiáng)T細(xì)胞的敏感性和反應(yīng)性：①穩(wěn)定TCR與對(duì)應(yīng)pMHC之間的弱相互作用；②將與共受體相關(guān)的酪氨酸激酶Lck招募至TCR信號(hào)復(fù)合物附近，從而促進(jìn)TCR信號(hào)級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)。然而，盡管大量研究支持CD8在后一效應(yīng)中的作用，且TCR對(duì)CD8依賴的親和力閾值在60-120µM之間，但CD4僅能加速TCR觸發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)，并不能穩(wěn)定TCR-pMHC的相互作用。這一功能因CD4與MHC分子之間的親和力極低而受到質(zhì)疑。盡管如此，共受體參與在TCR與pMHC結(jié)合過(guò)程中的重要性可由以下事實(shí)說(shuō)明：抗CD4和抗CD8抗體能夠減弱或阻斷某些抗體克隆甚至增強(qiáng)TCR與pMHC的相互作用程度。當(dāng)TCR以低親和力與pMHC結(jié)合時(shí)，這種抗體介導(dǎo)的阻斷或增強(qiáng)效應(yīng)更為顯著。此外，CD8共受體胞外域所提供的穩(wěn)定性對(duì)于增強(qiáng)低親和力TCR-T細(xì)胞的活化至關(guān)重要，但對(duì)于高親和力TCR-T細(xì)胞則非必需。研究發(fā)現(xiàn)，CD8共受體通過(guò)改變TCR–pMHC相互作用的結(jié)合和解離速率，在亞優(yōu)親和力條件下提高結(jié)合效率。此外，CD8通過(guò)將TCR–pMHC I類復(fù)合物以依賴于CD8與MHC親和力的速度動(dòng)員至膜微區(qū)，調(diào)節(jié)TCR的敏感性或觸發(fā)閾值。與胞外域不同，CD8的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谠鰪?qiáng)T細(xì)胞活化至關(guān)重要，且該作用獨(dú)立于TCR強(qiáng)度。降低這種依賴CD8/Lck的酪氨酸激酶活性會(huì)降低TCR的敏感性，從而阻礙T細(xì)胞效應(yīng)功能�；�于這些發(fā)現(xiàn)，TCR對(duì)其對(duì)應(yīng)pMHC親和力的不同決定了其對(duì)CD8依賴程度的差異。此外，使用pMHC多聚體的研究表明CD8在抗原特異性TCR結(jié)合中具有關(guān)鍵作用。在CD8結(jié)合位點(diǎn)帶有突變的四聚體選擇性地結(jié)合高avidity T細(xì)胞，而不結(jié)合低avidity T細(xì)胞。此外，CD8共受體的參與增強(qiáng)了T細(xì)胞與其對(duì)應(yīng)多聚體之間相互作用的avidity和穩(wěn)定性。上述觀察結(jié)果突顯了TCR共受體的存在或缺失如何影響T細(xì)胞與相應(yīng)pMHC分子之間的相互作用。此外，共受體表達(dá)水平或MHC結(jié)合能力的改變也會(huì)影響T細(xì)胞的功能。例如，HLA-A2 α3結(jié)構(gòu)域的人工突變導(dǎo)致CD8共受體無(wú)法結(jié)合，從而抑制了T細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞特異性裂解，但并未干擾TCR–pMHC的相互作用。相反，經(jīng)過(guò)人工改造、具有增強(qiáng)CD8結(jié)合能力的HLA-A*68分子則促進(jìn)了T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌。CD8與pMHC相互作用的功能效應(yīng)還體現(xiàn)在：只有在共受體參與的情況下，低親和力pMHC刺激的T細(xì)胞才能產(chǎn)生IFN-γ并表達(dá)CD107a表面標(biāo)志。最后，CD8對(duì)低親和力TCR的協(xié)同作用引發(fā)了針對(duì)自身肽段的非期望性自身反應(yīng)問(wèn)題。然而，T細(xì)胞可通過(guò)下調(diào)CD8膜表達(dá)來(lái)降低其functional avidity，從而減少自身反應(yīng)潛能。

4、癌癥特異性TCR的選擇
尋找癌癥特異性TCR候選物的一個(gè)良好起點(diǎn)，是從接受基于肽的疫苗或經(jīng)基因改造表達(dá)完整腫瘤抗原或負(fù)載目標(biāo)肽段的DC治療后產(chǎn)生應(yīng)答的患者體內(nèi)分離獲得。使用DC的基于肽或抗原mRNA的癌癥疫苗策略，主要著眼于提高抗原呈遞細(xì)胞表面表位密度，以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)一種或多種TAA的反應(yīng)。當(dāng)無(wú)法獲取患者自身細(xì)胞時(shí)，使用供體材料是另一種選擇�？赏ㄟ^(guò)自體負(fù)載肽的單核細(xì)胞來(lái)源DC來(lái)分離來(lái)自初始型庫(kù)的高親和力T細(xì)胞克隆，隨后用負(fù)載肽的PBMC進(jìn)行重復(fù)刺激。然而，由于針對(duì)自身抗原的高度反應(yīng)性克隆較為稀少，這種方法可能難以實(shí)現(xiàn)。另一種獲得腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的來(lái)源是異基因材料。在此情況下，使用配型不匹配的供體細(xì)胞，旨在獲得針對(duì)完整pMHC復(fù)合物而非僅針對(duì)肽段的異源反應(yīng)性T細(xì)胞。此外，用目標(biāo)肽段免疫過(guò)的轉(zhuǎn)基因小鼠也可作為具有通常表現(xiàn)出高親和力的鼠源TCR的來(lái)源。但該策略的一個(gè)缺點(diǎn)是異源TCR可能出現(xiàn)表位交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致脫靶反應(yīng)。為了提高TCR候選物的特異性和親和力，可利用病毒相關(guān)惡性腫瘤中的病毒抗原，但針對(duì)這些表位的反應(yīng)性T細(xì)胞的應(yīng)用將局限于部分患者。針對(duì)腫瘤新抗原的T細(xì)胞克隆正受到越來(lái)越多關(guān)注，因?yàn)檫@些新抗原是真正存在于癌組織而不存在于健康組織中的癌癥特異性表位。這些新抗原特異性T細(xì)胞為基因轉(zhuǎn)移提供了高度特異性的腫瘤反應(yīng)性TCR來(lái)源。然而，這一方法仍面臨一些挑戰(zhàn)，包括正確識(shí)別候選新表位，進(jìn)而準(zhǔn)確鑒定新抗原特異性T細(xì)胞克隆型，以及與腫瘤突變異質(zhì)性和這些抗原表位密度相關(guān)的其他難題。

無(wú)論其來(lái)源如何，所選的TCR候選物都應(yīng)通過(guò)pMHC多聚體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試，以確保其特異性和有效性（圖1）。這一點(diǎn)尤為重要，因?yàn)門CR對(duì)自身抗原的結(jié)合強(qiáng)度通常弱于例如病毒抗原。TCR親和力與T細(xì)胞免疫反應(yīng)之間的這種關(guān)聯(lián)，在表達(dá)病毒特異性TCR（高親和力）或腫瘤特異性TCR（低親和力）的工程化T細(xì)胞的不同反應(yīng)中得到了明確體現(xiàn)。此外，高親和力TCR通常比低親和力TCR更少依賴CD8共受體結(jié)合的作用。目前，pMHC多聚體被廣泛用作分析TCR avidity的首選方法，尤其適用于CD8陽(yáng)性T細(xì)胞，而利用pMHC II類多聚體檢測(cè)抗原特異性CD4 T細(xì)胞仍存在挑戰(zhàn)。然而，如前所述，pMHC多聚體并不能提供有關(guān)functional avidity的信息，甚至可能無(wú)法識(shí)別重要的抗原特異性TCR庫(kù)。為此，研究人員開發(fā)了一種TCR缺陷的CD8陽(yáng)性Jurkat衍生細(xì)胞系，用于快速且一致地評(píng)估克隆TCR的functional avidity。該細(xì)胞系稱為2D3，為T細(xì)胞functional avidity的測(cè)量提供了均一化/標(biāo)準(zhǔn)化的方法。它攜帶由活化T細(xì)胞核因子（NFAT）驅(qū)動(dòng)的EGFP報(bào)告基因，從而使TCR激活與EGFP表達(dá)相關(guān)聯(lián)。這種細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)之一是可通過(guò)任何類型的工程技術(shù)，方便地用編碼TCR的DNA或mRNA對(duì)其進(jìn)行遺傳修飾。還有研究人員在另一種Jurkat衍生細(xì)胞系中引入了三種熒光蛋白：EGFP、CFP和mCherry。借助這三參數(shù)報(bào)告平臺(tái)，可同時(shí)分析三個(gè)在T細(xì)胞活化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子——NFAT、NF-κB以及AP-1，以評(píng)估TCR功能。CD137是一種在CD8 T細(xì)胞刺激后24小時(shí)上調(diào)的活化標(biāo)志物，可用作從初始庫(kù)中不同擴(kuò)增T細(xì)胞亞群內(nèi)富集高親和力T細(xì)胞克隆的標(biāo)記。篩選親和力優(yōu)化TCR的最大挑戰(zhàn)之一是降低靶內(nèi)或脫靶交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。描述了一種掃描方法，可在識(shí)別有效TCR的同時(shí)，精確定位可能具有危險(xiǎn)性的TCR。該掃描方法首先基于affinity和functional avidity對(duì)天然TCR進(jìn)行初篩，隨后對(duì)這些TCR進(jìn)行親和力增強(qiáng)，并進(jìn)一步開展親和力和功能表征。最終候選分子則通過(guò)X-scan進(jìn)行比較，該系統(tǒng)將目標(biāo)肽段的所有殘基逐一突變?yōu)樗�有可能的氨基酸。這種全面的篩選確保候選分子僅識(shí)別目標(biāo)肽段，而不識(shí)別其他潛在肽段。

還強(qiáng)調(diào)了選擇正確APC以準(zhǔn)確分析TCR親和力的重要性。為了分析TCR親和力并預(yù)測(cè)腫瘤特異性TCR基因工程T細(xì)胞的敏感性，通常使用不同濃度（一般在μM范圍）的肽抗原對(duì)APC進(jìn)行致敏。其中，T2細(xì)胞系已成為此類實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。該細(xì)胞系缺乏抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TAP），導(dǎo)致細(xì)胞表面存在大量“空載”HLA分子。盡管這一特性在肽致敏實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)勢(shì)，但所使用的肽濃度遠(yuǎn)高于生理水平，與自然加工的TAA肽相比，可能導(dǎo)致TCR親和力的誤判。事實(shí)上，常規(guī)實(shí)驗(yàn)中常使用μM量級(jí)的肽段進(jìn)行致敏，而若要模擬表位的生理濃度，T2細(xì)胞應(yīng)使用低nM濃度的肽段。當(dāng)然，也可采用其他細(xì)胞系和檢測(cè)方法來(lái)評(píng)估腫瘤殺傷能力、細(xì)胞因子分泌（對(duì)由細(xì)胞因子風(fēng)暴引起的不良反應(yīng)至關(guān)重要），以及總體上任何反映T細(xì)胞適應(yīng)性和抗腫瘤反應(yīng)特異性的指標(biāo)。

5、TCR-T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)的改善
盡管TCR親和力與T細(xì)胞活性之間的相關(guān)性存在一些差異，但選擇高親和力TCR或提高低親和力TCR的親和力仍是增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)的一種手段（圖2）。目前采用多種技術(shù)進(jìn)行TCR親和力成熟，包括噬菌體展示系統(tǒng)——可實(shí)現(xiàn)pM級(jí)親和力的TCR、酵母TCR展示系統(tǒng)、結(jié)合丙氨酸掃描法以鑒定關(guān)鍵氨基酸殘基的哺乳動(dòng)物逆轉(zhuǎn)錄病毒展示系統(tǒng)、替換TCR CDRs中的關(guān)鍵氨基酸，以及利用體細(xì)胞高頻突變的方法。另一方面，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因TCR的二聚化及其在T細(xì)胞表面的表達(dá)水平，是提高TCR avidity及T細(xì)胞功能的有效途徑。TCR工程中的一個(gè)難點(diǎn)在于轉(zhuǎn)基因TCR表達(dá)水平較低，這主要是由于其與內(nèi)源性TCR發(fā)生錯(cuò)配，進(jìn)而可能導(dǎo)致有害的免疫反應(yīng)，并與內(nèi)源性TCR競(jìng)爭(zhēng)TCR復(fù)合物組裝機(jī)制。多年來(lái)已發(fā)展出多種技術(shù)來(lái)解決這一問(wèn)題，這些方法針對(duì)TCR分子機(jī)制的不同方面（圖2）。其中一種策略是通過(guò)shRNA沉默內(nèi)源性TCR序列，從而增加細(xì)胞表面轉(zhuǎn)基因TCR的數(shù)量并減少內(nèi)源性TCR的存在，shRNA可被包含在攜帶轉(zhuǎn)基因TCR的同一載體中，或通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA實(shí)現(xiàn)。在這兩種情況下，siRNA均靶向TCR鏈的恒定區(qū)，以便同時(shí)抑制多種內(nèi)源性TCR序列。完全去除內(nèi)源性TCR可通過(guò)ZFNs、TALENs或近期更常用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)等技術(shù)實(shí)現(xiàn)。盡管抑制內(nèi)源性TCR是減少TCR錯(cuò)配的簡(jiǎn)單方法，但其他策略則著眼于提高轉(zhuǎn)基因TCR的穩(wěn)定性，從而降低TCR錯(cuò)配（圖2）。因此，用于T細(xì)胞基因工程的TCR已被引入額外的二硫鍵進(jìn)行改造，該方法最近也被應(yīng)用于高親和力可溶性TCR。這一改造通過(guò)在TCR α鏈和β鏈中均引入半胱氨酸實(shí)現(xiàn)。另一種方法是將人TCR鏈的恒定區(qū)替換為小鼠αβ或人γδ TCR的恒定區(qū)。采用此策略時(shí)，αβ TCR鏈的恒定區(qū)被互換，以生成保留抗腫瘤功能的嵌合TCR。盡管此類改造增強(qiáng)了TCR的抗腫瘤功能，但異源成分的存在可能引發(fā)免疫原性，從而削弱細(xì)胞的作用效果。這一問(wèn)題可通過(guò)將TCR恒定區(qū)的關(guān)鍵殘基替換為小鼠來(lái)源的相應(yīng)殘基來(lái)解決。此外，盡管該策略仍會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)配的TCR，但這些錯(cuò)配產(chǎn)物無(wú)法與CD3結(jié)合，因而無(wú)功能活性。然而，使用這些策略仍可能發(fā)生錯(cuò)配。為大幅避免錯(cuò)誤配對(duì)，單鏈TCR基于TCR α和β鏈可變區(qū)通過(guò)連接肽融合而成。該結(jié)構(gòu)隨后與TCR β鏈恒定區(qū)連接形成單鏈TCR，而TCR α鏈恒定區(qū)則單獨(dú)添加，以允許招募CD3復(fù)合物。類似于完整的TCR，在可變區(qū)引入額外的二硫鍵可增強(qiáng)分子的穩(wěn)定性，并進(jìn)一步提升工程化細(xì)胞的功能活性。上述針對(duì)內(nèi)源性TCR庫(kù)或轉(zhuǎn)基因TCR結(jié)構(gòu)的改造手段當(dāng)然也可組合使用，以進(jìn)一步提高TCR的avidity并促進(jìn)更優(yōu)的T細(xì)胞應(yīng)答。

●圖2 增強(qiáng)腫瘤特異性TCR工程化T細(xì)胞。

6、TCR affinity與avidity在腫瘤特異性TCR工程T細(xì)胞中的臨床影響
用于癌癥治療的TCR工程化T細(xì)胞已在臨床應(yīng)用十余年，與此同時(shí)，人們普遍認(rèn)為TCR affinity與avidity在有效清除癌細(xì)胞方面具有重要作用。經(jīng)過(guò)親和力成熟優(yōu)化的TCR工程化T細(xì)胞已成功誘導(dǎo)表達(dá)MART-1、gp100、WT1蛋白、CEA、NY-ESO-1、LAGE-1或MAGE-A家族的腫瘤產(chǎn)生臨床應(yīng)答。盡管提高親和力的抗腫瘤TCR可增強(qiáng)對(duì)低表位密度腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力，但也增加了與正常組織抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。在使用親和力增強(qiáng)型TCR的臨床試驗(yàn)中已觀察到脫靶識(shí)別和交叉反應(yīng)現(xiàn)象。采用從經(jīng)CEA肽免疫小鼠中分離出的親和力增強(qiáng)型HLA-A02限制性TCR改造的T細(xì)胞導(dǎo)致嚴(yán)重但短暫的結(jié)腸炎；而來(lái)自MAGE-A3疫苗接種轉(zhuǎn)基因小鼠的親和力增強(qiáng)型HLA-A02限制性MAGE-A3/A9/A12特異性TCR因識(shí)別腦細(xì)胞表達(dá)的MAGE-A12引發(fā)神經(jīng)毒性。另一款針對(duì)骨髓瘤和黑色素瘤開發(fā)的高親和力HLA-A*01限制性MAGE-A3特異性TCR導(dǎo)致前兩名接受治療的患者出現(xiàn)心源性休克并最終死亡。臨床前研究未預(yù)測(cè)到脫靶反應(yīng)，然而攜帶該TCR的工程化T細(xì)胞因識(shí)別橫紋肌特異性肌聯(lián)蛋白衍生肽而在患者中引起嚴(yán)重心臟組織損傷。盡管未經(jīng)親和力優(yōu)化的TCR也可能導(dǎo)致致命不良事件，但此案例凸顯了在未充分評(píng)估交叉反應(yīng)性前使用親和力增強(qiáng)型TCR所存在的風(fēng)險(xiǎn)。為解決這一問(wèn)題，研究人員建立了一套體外廣泛的臨床前測(cè)試流程，通過(guò)包括人類腫瘤細(xì)胞系、原代腫瘤樣本以及表達(dá)多種HLA等位基因的EBV轉(zhuǎn)化B淋巴母細(xì)胞系（B-LCLs）組合，并結(jié)合分子分析手段，評(píng)估親和力增強(qiáng)型MAGE-A4特異性TCR的安全性和有效性。在完成該測(cè)試程序后，獲得了一個(gè)具備安全臨床特征的親和力增強(qiáng)型TCR候選物，用于后續(xù)臨床試驗(yàn)（NCT03132922，NCT04044768）。另一個(gè)與親和力增強(qiáng)型TCR相關(guān)的問(wèn)題是持續(xù)性的本底信號(hào)激活，即對(duì)HLA分子的持續(xù)識(shí)別所致。雖然這一問(wèn)題最初可能不會(huì)危及患者生命，但由于TCR–CD3下調(diào)及抑制性受體上調(diào)，會(huì)損害工程化T細(xì)胞的功能活性。值得慶幸的是，通過(guò)精細(xì)調(diào)節(jié)TCR親和力可能避免這種持續(xù)性激活。

內(nèi)源性TCR鏈與轉(zhuǎn)基因TCR鏈之間的錯(cuò)配問(wèn)題，盡管不僅限于高親和力TCR，但在過(guò)繼性TCR工程T細(xì)胞治療的安全性方面仍需引起重視。盡管迄今為止尚未報(bào)道由TCR錯(cuò)配相關(guān)的新生反應(yīng)所引起的不良事件，但這一潛在問(wèn)題可通過(guò)多種技術(shù)手段敲除內(nèi)源性TCR來(lái)解決（圖2），其中一些方法已在臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證并取得積極結(jié)果。特別是CRISPR-Cas9系統(tǒng)因其簡(jiǎn)便性、精確性和多功能性，徹底改變了癌癥治療中細(xì)胞基因工程的操作方式。最近，該方法已被用于難治性癌癥患者，通過(guò)多重編輯系統(tǒng)在導(dǎo)入腫瘤特異性TCR的同時(shí)，抑制T細(xì)胞內(nèi)源性TCR鏈以及負(fù)性免疫檢查點(diǎn)分子PD-1的表達(dá)。

對(duì)于難以分離出腫瘤特異性TCR的患者，使用健康供體的T細(xì)胞是一個(gè)不錯(cuò)的替代方案。這一選擇的優(yōu)勢(shì)之一在于，可以篩選大量T細(xì)胞數(shù)量未受影響的供體，直至獲得最佳的高親和力TCR。該策略的另一個(gè)問(wèn)題是供體TCR可能引起的脫靶反應(yīng)，這可通過(guò)與減少TCR錯(cuò)配相同的技術(shù)手段加以預(yù)防。由于來(lái)自細(xì)胞毒性CD8 T細(xì)胞的TCR可能存在嚴(yán)重毒性，因此從Tregs或輔助性CD4 T細(xì)胞中獲得的高親和力TCR成為腫瘤特異性TCR的另一種來(lái)源。盡管使用Treg來(lái)源的TCR引發(fā)了人們對(duì)工程化輔助性CD4 T細(xì)胞在體內(nèi)重定向?yàn)門reg的擔(dān)憂，但目前在患者中尚未觀察到此類現(xiàn)象，反而在轉(zhuǎn)移性癌癥患者中誘導(dǎo)了腫瘤消退。

總結(jié)
TCR affinity、avidity、共受體以及表位密度之間精妙的相互關(guān)系，突顯了在增強(qiáng)TCR affinity或avidity以感知低表位密度與避免潛在危險(xiǎn)的交叉反應(yīng)性之間取得平衡的重要性。為此，開發(fā)具有精細(xì)調(diào)控親和力的TCR新方法、從頭生成腫瘤特異性TCR，以及選擇新抗原或TAP非依賴性抗原作為腫瘤靶向的表位，將有助于制備更有效且更安全的TCR修飾T細(xì)胞。TCR療法的未來(lái)正逐步突破傳統(tǒng)T細(xì)胞的局限，非傳統(tǒng)淋巴細(xì)胞如γδ T細(xì)胞及其TCR，以及NK細(xì)胞，正在臨床前和臨床研究中被廣泛探索。這些細(xì)胞類型可規(guī)避TCR錯(cuò)配和交叉反應(yīng)的問(wèn)題，同時(shí)具備內(nèi)在的抗腫瘤活性。由于不會(huì)引發(fā)移植物抗宿主并發(fā)癥，它們還為開發(fā)即用型異基因產(chǎn)品提供了可能。此外，聯(lián)合使用細(xì)胞因子或免疫檢查點(diǎn)抑制劑以增強(qiáng)T細(xì)胞活性的策略，可能減少對(duì)構(gòu)建超生理親和力TCR的需求，從而避免嚴(yán)重不良反應(yīng)�？傊�，TCR-pMHC相互作用的復(fù)雜性，也即T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用的復(fù)雜性，要求TCR基因工程采取整體性策略，以開發(fā)更精準(zhǔn)、更有效的過(guò)繼性T細(xì)胞癌癥療法。