LAL檢測的工作原理及在細菌檢測領域的應用
盡管目前有多種方法可用于檢測細菌內毒素的存在，但鱟變形細胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）檢測仍是金標準。鱟（Limulus polyphemus）不僅外形奇特（見圖 1），而且的確來自另一個時代——距今 4.5 億年前！它當之無愧地被稱為“活化石”。
圖 1：鱟（Limulus polyphemus）醫學界對鱟血的興趣主要源于其中存在的變形細胞（amebocytes）。這些細胞在鱟的生存中至關重要，是其抵御真菌和革蘭氏陰性細菌的先天免疫關鍵。變形細胞內含有一種名為凝固原（coagulogen）的凝血因子。當它們接觸到存在于入侵細菌細胞壁中的細菌內毒素時，凝固原會被釋放并觸發一系列酶促反應，最終導致凝固（凝塊或膠化）、固定并中和病原體。凝血反應的起始點是凝血因子 C¹。這一特性可被用于檢測需符合特定安全標準的注射類（靜脈給藥）藥物。
LAL檢測的工作原理
變形細胞在檢測到細菌內毒素時產生可見反應的能力，是 LAL 檢測的基礎。LAL 檢測基于從鱟血中分離出的變形細胞裂解物（LAL）提取物¹。LAL 檢測主要有三種基本方法：凝膠凝塊法、顯色法和濁度法。
01 凝膠凝塊法
凝膠凝塊法是最初期且最簡單的 LAL 檢測方法。這是一種定性檢測，通過肉眼觀察樣品管底部是否形成凝塊或凝膠來判斷樣品中是否存在內毒素。
02 顯色法
顯色 LAL 檢測是一種定量檢測，其原理是：當樣品中的細菌內毒素激活鱟凝血因子 C 時，會觸發酶促反應，產生黃色（顯色）（見圖 2）。在試劑盒的特定檢測范圍內，顏色的強度與樣品中污染物的含量成正比——內毒素越多，溶液的黃色越深。顯色反應可通過分光光度計或酶標儀檢測吸光度進行定量（通常以 EU/mL 或 EU/樣品表示）。
圖 2：顯色 LAL 檢測的酶促級聯反應。鱟凝血因子 C 是反應的起點，最終產生黃色。顯色 LAL 檢測的動力學變體通過測量在加入底物后顯色反應開始的時間，并基于標準曲線插值來計算未知樣品的內毒素含量（見圖 3）。
圖 3：動力學顯色 LAL 檢測的信號曲線尤其在使用酶標儀進行定量時，顯色 LAL 檢測的優勢包括可提高效率和檢測通量，并且便于自動化。
03 濁度法
當樣品本身帶有顏色，可能干擾顯色 LAL 檢測的黃色讀數時，通常會使用 LAL 濁度法。在這種情況下，利用 LAL 凝血產生顆粒，使溶液變得渾濁，然后檢測其濁度。這種方法的檢測結果不會受樣品本身顏色影響。
在酶標儀上進行LAL測試
顯色法和濁度 LAL 測試均可使用酶標儀進行定量。這些方法非常簡單，只需使用吸收光酶標儀在 405-410 nm 波長下探測發色 LAL 反應的黃色出現，或在 340 nm 波長下探測 LAL 透射比濁法測定法的濁度變化。
所有配備吸收功能的 BMG LABTECH 酶標儀均可讀取 LAL 測定結果。這些酶標儀包括 SPECTROstar Nano、Omega 系列、VANTAstar、CLARIOstar Plus 和 PHERAstar FSX。
MARS 數據分析軟件也可用于進行動力學計算。對于此測試，比較每個樣品達到特定 OD 閾值所需的時間非常重要，該時間用于比較已知濃度的樣品，并創建用于計算未知值的標準曲線。
應用說明“Lonza 使用 BMG LABTECH 酶標儀和 MARS 數據分析進行內毒素探測的動力學試劑盒”提供了在酶標儀上運行顯色 LAL 檢測的示例。（點擊“閱讀原文”可在官網獲取）
LAL檢測與動物福利
不幸的是，LAL 的生產依賴于一種相對粗放的方式——捕捉鱟（2015 年超過 50 萬只），以采集少量血液（見圖 4）。雖然采血后鱟可以被釋放，但已知仍有約 10–30% 在運輸和/或采血過程中死亡。
圖 4：在采血設施中被采血的鱟²LAL替代方案
來自新加坡鱟的重組凝血因子 C 蛋白（rFC）已被克隆，作為潛在的“合成”LAL 替代品³。對 rFC 底物 B 因子的切割位點的了解，使得基于重組蛋白的檢測（稱為 rFC 檢測）得以開發。rFC 檢測的前景較好，因為它比 LAL 更敏感，且對內毒素的特異性更高²。
另一種替代方法是單核細胞活化試驗（MAT），這是一種體外細胞檢測方法，通過檢測單核細胞在內毒素驅動下釋放的細胞因子來判斷內毒素存在，通常結合 ELISA 檢測，原理基于單核細胞對病原體的先天免疫反應。
References
- Iwanaga S. Biochemical principle of Limulus test for detecting bacterial endotoxins. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2007 May;83(4):110-9. doi: 10.2183/pjab.83.110. PMID: 24019589; PMCID: PMC3756735.
- Maloney T, Phelan R, Simmons N (2018) Saving the horseshoe crab: A synthetic alternative to horseshoe crab blood for endotoxin detection. PLOS Biology 16(10): e2006607.
- Ding JL, Navas MA 3rd, Ho B. Molecular cloning and sequence analysis of factor C cDNA from the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda. Mol Mar Biol Biotechnol. 1995 Mar;4(1):90-103. PMID: 7538401.
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