基于TNS熒光法的LNP表觀pKa高通量測定
脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）是當(dāng)下生物醫(yī)藥領(lǐng)域突破性的工具，特別是在 mRNA 疫苗和治療的遞送中顯示出了其卓越的潛能。隨著 COVID-19 mRNA 疫苗的成功應(yīng)用，LNPs 的研究和開發(fā)獲得了前所未有的關(guān)注。這其中，精確測定 LNPs 的表觀 pKa 值對于優(yōu)化其遞送效率和安全性至關(guān)重要。
什么是 LNPs 的表觀 pKa？
酸解離常數(shù) (pKa) 的定義是體系中電離（質(zhì)子化）基團(tuán)和非電離基團(tuán)數(shù)目相等時的 pH 值，因此，LNPs 的表觀 pKa 就是 LNPs 中 50% 可電離脂質(zhì)質(zhì)子化的 pH 值。由于 pKa 決定了納米粒子的電離和表面電荷，這極大地影響了它們的穩(wěn)定性、效力和毒性，也影響了 LNPs 的細(xì)胞攝取、內(nèi)體釋放和生物分布，因此所以，精確測定 LNPs 的表觀 pKa 對于設(shè)計和優(yōu)化 mRNA 藥物非常關(guān)鍵。
LNP 表觀 pKa 測定的主要方法
目前 pKa 的測定方法包括酸堿滴定法和 TNS 熒光法，其中 TNS 熒光法具有靈敏高且操作便捷的優(yōu)點，已被廣泛用于測量 LNP 的 pKa，該方法可用 96 孔板體系配合高靈敏的熒光酶標(biāo)儀實現(xiàn)高通量檢測。
檢測原理：TNS（2 - 對甲苯氨基 - 6 萘磺酸）在水溶液中是非熒光的，帶負(fù)電荷，與陽離子脂類或聚合物結(jié)合并移動到疏水有機(jī)溶劑中顯示出強(qiáng)烈的熒光如圖 1 所示，隨著 pH 值的降低，TNS 和可電離表面的相互作用增加，從而熒光穩(wěn)定增加， 當(dāng)在特定的 pH 值下，所有的可電離基團(tuán)帶電荷，熒光值達(dá)到最大，通過達(dá)到最大熒光值的一半的 pH 估算 pKa。
圖 1：使用 SynergyNeo2，設(shè)置激發(fā)光 321nm，掃描 TNS 的發(fā)射光光譜，掃描步進(jìn) 1nm。獲得 TNS 在 DMF 溶液中的熒光發(fā)射光譜，可見在 426nm 處有顯著的發(fā)射峰。
TNS 法主要檢測流程：
實驗結(jié)果展示
ALC-0135 和 SM-102 是用于 LNP 配方的可電離脂質(zhì)。通過 TNS 測定 pKa 值。圖 2 展示了 ALC-0135 和 SM-102 的 TNS 熒光滴定曲線。結(jié)果表明，ALC-0135 和 SM-102 脂質(zhì)均可電離，其 pKa 值分別為 6.11 和 6.55。
此外，使用 SynergyNeo2 檢測了裝載 mRNA 的 LNPs 的表觀 pKa，圖 3 為不同 pH 值下 mRNA LNPs 的 TNS 熒光滴定曲線。結(jié)果表明，在低 pH 下，SM-102 LNPs 含有可電離基團(tuán)，會帶正電，從而抑制 TNS 自猝滅，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號。在高 pH 下，SM-102 LNPs 將不帶電。最后計算測得 mRNA LNP 表面 pKa 值約為 6.75，與文獻(xiàn)一致。此外對照樣本 DOTAP 是一種陽離子脂質(zhì)，含有永久帶電基團(tuán)，因此在所有 pH 水平下都能夠測得高熒光信號。
BioTek Synergy Neo2 全功能酶標(biāo)儀
先進(jìn)的高性能高速微孔板檢測儀。功能全面、靈活的 Synergy Neo2 不僅能夠提供 LNPs 的表觀 pKa 檢測，也支持更為靈活廣泛的實驗檢測需求，提供出色實驗結(jié)果。
主要優(yōu)勢：
相關(guān)產(chǎn)品：
Synergy Neo 2 Hybrid 多功能微孔板檢測儀
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
什么是 LNPs 的表觀 pKa？
酸解離常數(shù) (pKa) 的定義是體系中電離（質(zhì)子化）基團(tuán)和非電離基團(tuán)數(shù)目相等時的 pH 值，因此，LNPs 的表觀 pKa 就是 LNPs 中 50% 可電離脂質(zhì)質(zhì)子化的 pH 值。由于 pKa 決定了納米粒子的電離和表面電荷，這極大地影響了它們的穩(wěn)定性、效力和毒性，也影響了 LNPs 的細(xì)胞攝取、內(nèi)體釋放和生物分布，因此所以，精確測定 LNPs 的表觀 pKa 對于設(shè)計和優(yōu)化 mRNA 藥物非常關(guān)鍵。
LNP 表觀 pKa 測定的主要方法
目前 pKa 的測定方法包括酸堿滴定法和 TNS 熒光法，其中 TNS 熒光法具有靈敏高且操作便捷的優(yōu)點，已被廣泛用于測量 LNP 的 pKa，該方法可用 96 孔板體系配合高靈敏的熒光酶標(biāo)儀實現(xiàn)高通量檢測。
檢測原理：TNS（2 - 對甲苯氨基 - 6 萘磺酸）在水溶液中是非熒光的，帶負(fù)電荷，與陽離子脂類或聚合物結(jié)合并移動到疏水有機(jī)溶劑中顯示出強(qiáng)烈的熒光如圖 1 所示，隨著 pH 值的降低，TNS 和可電離表面的相互作用增加，從而熒光穩(wěn)定增加， 當(dāng)在特定的 pH 值下，所有的可電離基團(tuán)帶電荷，熒光值達(dá)到最大，通過達(dá)到最大熒光值的一半的 pH 估算 pKa。
TNS 法主要檢測流程：
- 1. 準(zhǔn)備 buffer 溶液：pH 值在 3-10 pH（0.5 個單位變化）。
- 2. 用不同梯度的 buffer 溶液稀釋待測的 LNPs 和 TNS 溶液，調(diào)整終濃度為 30 和 6 µM，制備復(fù)孔并加入到96孔板中。
- 3. 使用 SynergyNeo2 進(jìn)行熒光讀數(shù) Ex/Em = 321nm/445nm），將均一化的熒光強(qiáng)度讀數(shù)結(jié)果和 pH 值進(jìn)行曲線擬合，計算 pKa。
實驗結(jié)果展示
ALC-0135 和 SM-102 是用于 LNP 配方的可電離脂質(zhì)。通過 TNS 測定 pKa 值。圖 2 展示了 ALC-0135 和 SM-102 的 TNS 熒光滴定曲線。結(jié)果表明，ALC-0135 和 SM-102 脂質(zhì)均可電離，其 pKa 值分別為 6.11 和 6.55。
圖 2：可電離脂質(zhì)的 TNS 熒光滴定曲線
此外，使用 SynergyNeo2 檢測了裝載 mRNA 的 LNPs 的表觀 pKa，圖 3 為不同 pH 值下 mRNA LNPs 的 TNS 熒光滴定曲線。結(jié)果表明，在低 pH 下，SM-102 LNPs 含有可電離基團(tuán)，會帶正電，從而抑制 TNS 自猝滅，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號。在高 pH 下，SM-102 LNPs 將不帶電。最后計算測得 mRNA LNP 表面 pKa 值約為 6.75，與文獻(xiàn)一致。此外對照樣本 DOTAP 是一種陽離子脂質(zhì)，含有永久帶電基團(tuán)，因此在所有 pH 水平下都能夠測得高熒光信號。
圖 3：不同 pH 值下的 TNS 熒光滴定曲線
BioTek Synergy Neo2 全功能酶標(biāo)儀
先進(jìn)的高性能高速微孔板檢測儀。功能全面、靈活的 Synergy Neo2 不僅能夠提供 LNPs 的表觀 pKa 檢測，也支持更為靈活廣泛的實驗檢測需求，提供出色實驗結(jié)果。
主要優(yōu)勢：
- Hybrid 獨立雙光路系統(tǒng)：兼容靈活性和高性能
- 帶寬可設(shè)置在 3nm 到 50nm 之間，步進(jìn)為 1nm，實現(xiàn)靈敏度和特異性優(yōu)化
- 支持雙 PMT 熒光發(fā)射檢測用于高速篩選
- 可配置兩個激光器用于 TRF、TR-FRET 和 Alpha 檢測
- 拓展功能優(yōu)異，支持活細(xì)胞檢測、微量樣品檢測、自動進(jìn)樣器以及自動化產(chǎn)品對接
相關(guān)產(chǎn)品：
Synergy Neo 2 Hybrid 多功能微孔板檢測儀
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
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