iPS細胞凍存的核心原理及標準操作流程
在人多能干細胞的研究世界中，iPS細胞無疑是最耀眼的明星。它們承載著疾病建模、藥物篩選乃至未來再生醫學的無限可能。然而，這些珍貴的細胞既嬌貴又“永生”，如何讓它們在需要時“暫停”生長，在未來的某一刻被完美“喚醒”，成為了每個實驗室的必修課。今天，我們就來深入聊聊iPS細胞凍存的那些事兒——這不僅是一項技術，更是一門藝術。
給細胞一個時光膠囊
你可能會有疑問，iPS細胞不是可以無限增殖嗎？為何還要大費周章地凍存？
資源保種：防止珍貴細胞系因連續傳代、污染或意外而丟失。每一株iPS細胞系，尤其是來自特定患者的，都是獨一無二的生物資源。
實驗規劃：在遺傳操作、分化實驗等關鍵節點前，凍存原始細胞，相當于設置了“安全存檔點”。
降低成本：長期維持細胞培養耗費大量人力、物力和試劑成本。凍存可以讓研究間歇期“零消耗”。
資源共享：便于在不同實驗室、不同地區之間進行細胞系的交換與運輸。
簡單來說，凍存就是為iPS細胞打造了一個“生命暫停”的時光膠囊，確保我們在需要時，總能獲得狀態均一、純凈的起始材料。
凍存核心原理：與冰晶賽跑
細胞凍存的關鍵，在于如何避免細胞內形成致命的冰晶。冰晶會像無數利刺，摧毀細胞的膜結構和內部機器。我們的對策是：
慢速降溫：使用程序性降溫盒或可控速率降溫儀，以每分鐘下降1℃的速度緩慢冷卻。這能讓細胞內的水分有充足時間滲透到細胞外，減少細胞內冰晶的形成。
使用凍存液：凍存液中的DMSO 能降低細胞的冰點，增加膜通透性，幫助水分滲出。同時，會搭配胎牛血清或無雙血清替代品作為保護基質，減少DMSO的毒性。
記住：凍存的敵人不是低溫本身，而是形成冰晶的過程。
標準操作流程
【凍存前準備】
細胞狀態是關鍵：選擇對數生長期、形態良好、克隆邊界清晰、無分化的細胞。凍存前24小時更換新鮮培養基。
高密度，高存活：消化離心后，用預冷的凍存液重懸細胞。建議凍存密度為1-3 x 10⁶ cells/mL。濃度過低會導致復蘇后生長遲緩。
【凍存步驟】
消化收集：用常規消化法（如EDTA或Accutase）將細胞消化成單細胞懸液，離心。
配制凍存液：按比例配制凍存液（經典配方：90% 基礎培養基/FBS + 10% DMSO）。現用現配，并置于冰上預冷，以最大限度減少DMSO對細胞的毒性。
重懸分裝：用凍存液輕柔重懸細胞，并迅速分裝至已標記的凍存管中（通常1-1.5mL/管）。確保標簽信息清晰、防水。
程序降溫：將凍存管立即放入程序性降溫盒，并轉移至-80℃超低溫冰箱過夜（約12-24小時）。切勿直接放入-80℃或液氮！
長期保存：24小時內，必須將凍存管轉移至液氮中長期保存。在-80℃中細胞會緩慢失活，只有液氮（-196℃）才能實現真正的“生命暫停”。
2TWO常見誤區與避坑指南
誤區一：細胞狀態無所謂？
正解：凍存是細胞狀態的“快照”。分化、狀態不佳的細胞，凍存后再復蘇，只會更差。
誤區二：DMSO濃度越高越好？
正解：10%是經典安全濃度。過高會增加毒性，過低則保護不足。
誤區三：凍存管可以直接扔進-80℃？
正解：快速冷凍會導致細胞內形成大量冰晶，細胞死亡率極高。程序性降溫是必須步驟。
誤區四：凍存后萬事大吉？
正解：定期檢查液氮罐液位，做好庫存管理，防止因液氮耗盡導致全軍覆沒。
復蘇
“秒”速水浴：從液氮中取出凍存管，立即放入37℃水浴鍋中，不斷搖晃，使其在1-2分鐘內完全融化。
輕柔稀釋：將細胞懸液轉移至含有多倍體積預熱培養基的離心管中，輕柔混勻。這一步是為了稀釋對細胞有毒性的DMSO。
離心換液：離心后，棄去上清，用新鮮培養基重懸細胞，接種至輔有基質膠的培養皿中。
精心呵護：復蘇后第二天及時換液，清除死細胞。密切關注細胞貼壁和生長情況。
