基于TNS熒光法的LNP表觀pKa高通量測定
脂質納米顆粒（LNPs）是當下生物醫藥領域突破性的工具，特別是在 mRNA 疫苗和治療的遞送中顯示出了其卓越的潛能。隨著 COVID-19 mRNA 疫苗的成功應用，LNPs 的研究和開發獲得了前所未有的關注。這其中，精確測定 LNPs 的表觀 pKa 值對于優化其遞送效率和安全性至關重要。
什么是 LNPs 的表觀 pKa？
酸解離常數 (pKa) 的定義是體系中電離（質子化）基團和非電離基團數目相等時的 pH 值，因此，LNPs 的表觀 pKa 就是 LNPs 中 50% 可電離脂質質子化的 pH 值。由于 pKa 決定了納米粒子的電離和表面電荷，這極大地影響了它們的穩定性、效力和毒性，也影響了 LNPs 的細胞攝取、內體釋放和生物分布，因此所以，精確測定 LNPs 的表觀 pKa 對于設計和優化 mRNA 藥物非常關鍵。
LNP 表觀 pKa 測定的主要方法
目前 pKa 的測定方法包括酸堿滴定法和 TNS 熒光法，其中 TNS 熒光法具有靈敏高且操作便捷的優點，已被廣泛用于測量 LNP 的 pKa，該方法可用 96 孔板體系配合高靈敏的熒光酶標儀實現高通量檢測。
檢測原理：TNS（2 - 對甲苯氨基 - 6 萘磺酸）在水溶液中是非熒光的，帶負電荷，與陽離子脂類或聚合物結合并移動到疏水有機溶劑中顯示出強烈的熒光如圖 1 所示，隨著 pH 值的降低，TNS 和可電離表面的相互作用增加，從而熒光穩定增加， 當在特定的 pH 值下，所有的可電離基團帶電荷，熒光值達到最大，通過達到最大熒光值的一半的 pH 估算 pKa。
圖 1：使用 SynergyNeo2，設置激發光 321nm，掃描 TNS 的發射光光譜，掃描步進 1nm。獲得 TNS 在 DMF 溶液中的熒光發射光譜，可見在 426nm 處有顯著的發射峰。
TNS 法主要檢測流程：
實驗結果展示
ALC-0135 和 SM-102 是用于 LNP 配方的可電離脂質。通過 TNS 測定 pKa 值。圖 2 展示了 ALC-0135 和 SM-102 的 TNS 熒光滴定曲線。結果表明，ALC-0135 和 SM-102 脂質均可電離，其 pKa 值分別為 6.11 和 6.55。
此外，使用 SynergyNeo2 檢測了裝載 mRNA 的 LNPs 的表觀 pKa，圖 3 為不同 pH 值下 mRNA LNPs 的 TNS 熒光滴定曲線。結果表明，在低 pH 下，SM-102 LNPs 含有可電離基團，會帶正電，從而抑制 TNS 自猝滅，產生強烈的熒光信號。在高 pH 下，SM-102 LNPs 將不帶電。最后計算測得 mRNA LNP 表面 pKa 值約為 6.75，與文獻一致。此外對照樣本 DOTAP 是一種陽離子脂質，含有永久帶電基團，因此在所有 pH 水平下都能夠測得高熒光信號。
BioTek Synergy Neo2 全功能酶標儀
先進的高性能高速微孔板檢測儀。功能全面、靈活的 Synergy Neo2 不僅能夠提供 LNPs 的表觀 pKa 檢測，也支持更為靈活廣泛的實驗檢測需求，提供出色實驗結果。
主要優勢：
相關產品：
Synergy Neo 2 Hybrid 多功能微孔板檢測儀
關于安捷倫細胞分析
安捷倫細胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細胞分析儀、NovoCyte系列流式細胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細胞分析平臺聚焦基礎科研與細胞與基因治療產品的開發全流程，作為適配新一代療法的強大分析工具，提供多方位的細胞效力檢測和深度的細胞分析，并致力于研發、生產質控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發。
什么是 LNPs 的表觀 pKa？
酸解離常數 (pKa) 的定義是體系中電離（質子化）基團和非電離基團數目相等時的 pH 值，因此，LNPs 的表觀 pKa 就是 LNPs 中 50% 可電離脂質質子化的 pH 值。由于 pKa 決定了納米粒子的電離和表面電荷，這極大地影響了它們的穩定性、效力和毒性，也影響了 LNPs 的細胞攝取、內體釋放和生物分布，因此所以，精確測定 LNPs 的表觀 pKa 對于設計和優化 mRNA 藥物非常關鍵。
LNP 表觀 pKa 測定的主要方法
目前 pKa 的測定方法包括酸堿滴定法和 TNS 熒光法，其中 TNS 熒光法具有靈敏高且操作便捷的優點，已被廣泛用于測量 LNP 的 pKa，該方法可用 96 孔板體系配合高靈敏的熒光酶標儀實現高通量檢測。
檢測原理：TNS（2 - 對甲苯氨基 - 6 萘磺酸）在水溶液中是非熒光的，帶負電荷，與陽離子脂類或聚合物結合并移動到疏水有機溶劑中顯示出強烈的熒光如圖 1 所示，隨著 pH 值的降低，TNS 和可電離表面的相互作用增加，從而熒光穩定增加， 當在特定的 pH 值下，所有的可電離基團帶電荷，熒光值達到最大，通過達到最大熒光值的一半的 pH 估算 pKa。
TNS 法主要檢測流程：
- 1. 準備 buffer 溶液：pH 值在 3-10 pH（0.5 個單位變化）。
- 2. 用不同梯度的 buffer 溶液稀釋待測的 LNPs 和 TNS 溶液，調整終濃度為 30 和 6 µM，制備復孔并加入到96孔板中。
- 3. 使用 SynergyNeo2 進行熒光讀數 Ex/Em = 321nm/445nm），將均一化的熒光強度讀數結果和 pH 值進行曲線擬合，計算 pKa。
實驗結果展示
ALC-0135 和 SM-102 是用于 LNP 配方的可電離脂質。通過 TNS 測定 pKa 值。圖 2 展示了 ALC-0135 和 SM-102 的 TNS 熒光滴定曲線。結果表明，ALC-0135 和 SM-102 脂質均可電離，其 pKa 值分別為 6.11 和 6.55。
圖 2：可電離脂質的 TNS 熒光滴定曲線
此外，使用 SynergyNeo2 檢測了裝載 mRNA 的 LNPs 的表觀 pKa，圖 3 為不同 pH 值下 mRNA LNPs 的 TNS 熒光滴定曲線。結果表明，在低 pH 下，SM-102 LNPs 含有可電離基團，會帶正電，從而抑制 TNS 自猝滅，產生強烈的熒光信號。在高 pH 下，SM-102 LNPs 將不帶電。最后計算測得 mRNA LNP 表面 pKa 值約為 6.75，與文獻一致。此外對照樣本 DOTAP 是一種陽離子脂質，含有永久帶電基團，因此在所有 pH 水平下都能夠測得高熒光信號。
圖 3：不同 pH 值下的 TNS 熒光滴定曲線
BioTek Synergy Neo2 全功能酶標儀
先進的高性能高速微孔板檢測儀。功能全面、靈活的 Synergy Neo2 不僅能夠提供 LNPs 的表觀 pKa 檢測，也支持更為靈活廣泛的實驗檢測需求，提供出色實驗結果。
主要優勢：
- Hybrid 獨立雙光路系統：兼容靈活性和高性能
- 帶寬可設置在 3nm 到 50nm 之間，步進為 1nm，實現靈敏度和特異性優化
- 支持雙 PMT 熒光發射檢測用于高速篩選
- 可配置兩個激光器用于 TRF、TR-FRET 和 Alpha 檢測
- 拓展功能優異，支持活細胞檢測、微量樣品檢測、自動進樣器以及自動化產品對接
相關產品：
Synergy Neo 2 Hybrid 多功能微孔板檢測儀
關于安捷倫細胞分析
安捷倫細胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細胞分析儀、NovoCyte系列流式細胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細胞分析平臺聚焦基礎科研與細胞與基因治療產品的開發全流程，作為適配新一代療法的強大分析工具，提供多方位的細胞效力檢測和深度的細胞分析，并致力于研發、生產質控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發。
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