標(biāo)簽蛋白純化（親和層析）實(shí)驗(yàn)問題自查方法及優(yōu)化小技巧

親和層析是一種基于生物分子間特異性相互作用的純化技術(shù)，通常用在標(biāo)簽蛋白純化的第一步。親和層析實(shí)驗(yàn)過程中，特別是純化新手，遇到一些問題不知道該如何下手，今天小優(yōu)就帶大家來了解一下遇到問題應(yīng)該怎樣自查和優(yōu)化，讓你不再束手無策~

1、沒有收集到目標(biāo)蛋白
問題描述：在蛋白純化過程中，使用洗脫液對填料上的目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫，在收集液中沒有檢測到目標(biāo)蛋白。
問題自查1：蛋白表達(dá)情況怎么樣？目標(biāo)蛋白是否有正常表達(dá)？標(biāo)簽是否正常表達(dá)且沒有被折疊覆蓋？
（1）蛋白樣品在用填料純化之前，先跑下SDS-PAGE膠并用考馬斯亮藍(lán)染色，如果能看到比較清晰且較粗的目標(biāo)蛋白條帶，則表達(dá)量較高；
（2）蛋白樣品跑WB，用標(biāo)簽抗體檢測，如果能檢測到目標(biāo)條帶，則標(biāo)簽有正常表達(dá)；
（3）檢測蛋白樣品中的蛋白濃度，并結(jié)合SDS-PAGE顯示的目標(biāo)蛋白的占比，可以估算出目標(biāo)蛋白的表達(dá)量;
（4）如果目標(biāo)蛋白數(shù)量較多，且想要拿到比較準(zhǔn)確的濃度數(shù)據(jù)，也可以使用His tag OneStep ELISA Kit（貨號(hào)S0C3016）進(jìn)行檢測，可以最多一次性同時(shí)檢測80個(gè)樣品；
（5）或者也可以考慮在目標(biāo)蛋白同時(shí)加上GFP等熒光標(biāo)記，通過熒光檢測得到蛋白表達(dá)量；
（6）如果蛋白上清液中沒有檢測到蛋白，且在沉淀中有大量蛋白，此時(shí)可能是蛋白形成了包涵體；

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化1：
如果蛋白表達(dá)量不高，需要對前期質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)過程進(jìn)行優(yōu)化。例如更換表達(dá)載體，更換標(biāo)簽，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，篩選大腸桿菌培養(yǎng)溫度和時(shí)間，篩選誘導(dǎo)劑（如IPTG）濃度，誘導(dǎo)溫度和時(shí)間等；

問題自查2：目標(biāo)蛋白到哪里去了？是沒有結(jié)合在柱子上，還是在柱子上沒有洗脫下來？
同時(shí)收集上樣和洗雜時(shí)的流穿液以及洗脫目標(biāo)蛋白時(shí)的洗脫液，如果流穿液中有大量的目標(biāo)蛋白，則表示目標(biāo)蛋白沒有和填料有效結(jié)合；如果流穿液和洗脫液中都沒有目標(biāo)蛋白，則表示目標(biāo)蛋白可能還結(jié)合在柱子上，沒有洗脫下來；

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化2：
流穿液中有目標(biāo)蛋白：
（1）His標(biāo)簽
● 樣品或結(jié)合緩沖液條件不合適：樣品和結(jié)合緩沖液中不能含有高濃度的金屬螯合劑（例如EDTA），高濃度強(qiáng)還原劑（例如DTT），或者高濃度的咪唑；
● His標(biāo)簽和填料結(jié)合較弱：適當(dāng)降低上樣流速并增加孵育時(shí)間；增加His標(biāo)簽的數(shù)量（6-10個(gè)）；
● 調(diào)整結(jié)合緩沖液的PH為7-8，PH過低會(huì)影響蛋白結(jié)合；
● 上樣量超出填料載量：使用更大體積的層析柱；

（2）GST標(biāo)簽
● 樣品制備超聲過度：使用溫和的超聲條件；加入溶菌酶促進(jìn)裂解；
● GST氧化聚集：加入DTT（1-10 mM）增加蛋白的結(jié)合；
● 調(diào)整結(jié)合緩沖液的PH為6.5-8，在純化前平衡層析柱；GST結(jié)合動(dòng)力學(xué)慢，可降低上樣流速；提高樣品濃度有利于目的蛋白結(jié)合；
● 上樣量超出填料載量：使用更大體積的層析柱；

目標(biāo)蛋白沒有洗脫下來：
（1）His標(biāo)簽
● 洗脫條件過于溫和：適當(dāng)增加洗脫緩沖液中的咪唑濃度，或者嘗試降低洗脫液的PH；增加洗脫步驟和時(shí)間；
● 目標(biāo)蛋白與填料發(fā)生非特異性結(jié)合：在洗脫緩沖液中加入非離子型去垢劑（例如2% Triton X-100），或者增加洗脫液中NaCl的濃度；
● 目標(biāo)蛋白在填料上發(fā)生了沉淀：減少上樣量，添加去垢劑或者在變性條件下進(jìn)行洗脫；

（2）GST標(biāo)簽
● 增加洗脫緩沖液的用量，增長洗脫時(shí)間；
● 適當(dāng)提高洗脫緩沖液中還原型谷胱甘肽的濃度（20-40 mM）；
● 洗脫緩沖液PH過低：提高PH至8-9可促進(jìn)洗脫；提高洗脫液中的離子強(qiáng)度（適當(dāng)增加0.1-0.2 M NaCl）；適當(dāng)加入DTT（1-10 mM）抑制還原型谷胱甘肽被氧化；
● 目標(biāo)蛋白和填料間發(fā)生非特異相互作用：在洗脫緩沖液中加入非離子型去垢劑（例如0.1% Triton X-100）；

2、蛋白純度不高，雜帶較多
問題描述：收集液中有目標(biāo)蛋白，但同時(shí)也有很多雜蛋白。這種情況一般發(fā)生在使用His標(biāo)簽時(shí)，以下主要對His標(biāo)簽蛋白純化進(jìn)行講解。
問題自查1：是否目標(biāo)蛋白本身表達(dá)不高，而雜蛋白表達(dá)較高；按照問題1中的方法檢測目標(biāo)蛋白表達(dá)；
實(shí)驗(yàn)優(yōu)化1：優(yōu)化質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)的步驟；

問題自查2：蛋白是否容易降解？
在SDS-PAGE膠上觀察雜帶的分子量；如果雜帶的分子量比目標(biāo)蛋白分子量小，且相差值約為幾個(gè)結(jié)構(gòu)域或特定酶切位點(diǎn)，說明可能該雜帶是由目標(biāo)蛋白降解產(chǎn)生的。

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化2：
在裂解液和緩沖液中添加蛋白酶抑制劑（EDTA除外）；整個(gè)實(shí)驗(yàn)保持在低溫下進(jìn)行；盡量縮短前期樣品處理的時(shí)間；使用Cytiva帶有預(yù)過濾濾膜的HisTrap FF Crude柱子（貨號(hào)29048631），樣品無需過濾直接上樣，減少前期處理時(shí)間。

其他實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：
● 雜蛋白對填料也有較強(qiáng)的結(jié)合：優(yōu)化結(jié)合，洗脫條件；增加后續(xù)其他的純化步驟（離子交換，凝膠過濾等）；替換其他的標(biāo)簽；構(gòu)建雙標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)蛋白；嘗試使用其他的金屬離子（例如Co2+，貨號(hào)29048565）;
● 雜蛋白與目標(biāo)蛋白存在非特異結(jié)合：裂解液和緩沖液中添加去垢劑（2% Triton X-100/Tween 20）；或添加甘油（20%以內(nèi)）；增加緩沖液中NaCl濃度至500 mM；
● 洗雜過程優(yōu)化：在結(jié)合緩沖液中添加10-20 mM咪唑；重復(fù)洗雜的步驟；
● 梯度洗脫：使用咪唑梯度濃度洗脫；

3、柱子堵了
問題描述：柱子發(fā)生堵塞，流速降低，壓力增高；此時(shí)需要根據(jù)說明書對層析柱進(jìn)行清洗。
問題自查1：樣品和緩沖液上樣前有沒有過濾？
實(shí)驗(yàn)優(yōu)化1：收集到蛋白樣品之后，建議先用超聲破碎，然后離心取上清，然后使用0.45um或者0.2um的濾膜進(jìn)行過濾；
問題自查2：是否樣品濃度或者粘性過高？
實(shí)驗(yàn)優(yōu)化2：可以適當(dāng)稀釋樣品；如果樣品粘性比較高，也可能是樣品中含有高濃度的宿主核酸，可以增加超聲時(shí)間，或者加入核酸酶（5 ug/ml DNase1,1 mM Mg2+）進(jìn)行處理。
問題自查3：層析柱有沒有定期清洗？
實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：層析柱在使用5-10次之后，建議對層析柱進(jìn)行常規(guī)清洗。清洗方法可以參考說明書。

部分標(biāo)簽親和熱賣產(chǎn)品