標簽蛋白純化（親和層析）實驗問題自查方法及優化小技巧

親和層析是一種基于生物分子間特異性相互作用的純化技術，通常用在標簽蛋白純化的第一步。親和層析實驗過程中，特別是純化新手，遇到一些問題不知道該如何下手，今天小優就帶大家來了解一下遇到問題應該怎樣自查和優化，讓你不再束手無策~

1、沒有收集到目標蛋白
問題描述：在蛋白純化過程中，使用洗脫液對填料上的目標蛋白進行洗脫，在收集液中沒有檢測到目標蛋白。
問題自查1：蛋白表達情況怎么樣？目標蛋白是否有正常表達？標簽是否正常表達且沒有被折疊覆蓋？
（1）蛋白樣品在用填料純化之前，先跑下SDS-PAGE膠并用考馬斯亮藍染色，如果能看到比較清晰且較粗的目標蛋白條帶，則表達量較高；
（2）蛋白樣品跑WB，用標簽抗體檢測，如果能檢測到目標條帶，則標簽有正常表達；
（3）檢測蛋白樣品中的蛋白濃度，并結合SDS-PAGE顯示的目標蛋白的占比，可以估算出目標蛋白的表達量;
（4）如果目標蛋白數量較多，且想要拿到比較準確的濃度數據，也可以使用His tag OneStep ELISA Kit（貨號S0C3016）進行檢測，可以最多一次性同時檢測80個樣品；
（5）或者也可以考慮在目標蛋白同時加上GFP等熒光標記，通過熒光檢測得到蛋白表達量；
（6）如果蛋白上清液中沒有檢測到蛋白，且在沉淀中有大量蛋白，此時可能是蛋白形成了包涵體；

實驗優化1：
如果蛋白表達量不高，需要對前期質粒構建和蛋白表達過程進行優化。例如更換表達載體，更換標簽，進行密碼子優化，篩選大腸桿菌培養溫度和時間，篩選誘導劑（如IPTG）濃度，誘導溫度和時間等；

問題自查2：目標蛋白到哪里去了？是沒有結合在柱子上，還是在柱子上沒有洗脫下來？
同時收集上樣和洗雜時的流穿液以及洗脫目標蛋白時的洗脫液，如果流穿液中有大量的目標蛋白，則表示目標蛋白沒有和填料有效結合；如果流穿液和洗脫液中都沒有目標蛋白，則表示目標蛋白可能還結合在柱子上，沒有洗脫下來；

實驗優化2：
流穿液中有目標蛋白：
（1）His標簽
● 樣品或結合緩沖液條件不合適：樣品和結合緩沖液中不能含有高濃度的金屬螯合劑（例如EDTA），高濃度強還原劑（例如DTT），或者高濃度的咪唑；
● His標簽和填料結合較弱：適當降低上樣流速并增加孵育時間；增加His標簽的數量（6-10個）；
● 調整結合緩沖液的PH為7-8，PH過低會影響蛋白結合；
● 上樣量超出填料載量：使用更大體積的層析柱；

（2）GST標簽
● 樣品制備超聲過度：使用溫和的超聲條件；加入溶菌酶促進裂解；
● GST氧化聚集：加入DTT（1-10 mM）增加蛋白的結合；
● 調整結合緩沖液的PH為6.5-8，在純化前平衡層析柱；GST結合動力學慢，可降低上樣流速；提高樣品濃度有利于目的蛋白結合；
● 上樣量超出填料載量：使用更大體積的層析柱；

目標蛋白沒有洗脫下來：
（1）His標簽
● 洗脫條件過于溫和：適當增加洗脫緩沖液中的咪唑濃度，或者嘗試降低洗脫液的PH；增加洗脫步驟和時間；
● 目標蛋白與填料發生非特異性結合：在洗脫緩沖液中加入非離子型去垢劑（例如2% Triton X-100），或者增加洗脫液中NaCl的濃度；
● 目標蛋白在填料上發生了沉淀：減少上樣量，添加去垢劑或者在變性條件下進行洗脫；

（2）GST標簽
● 增加洗脫緩沖液的用量，增長洗脫時間；
● 適當提高洗脫緩沖液中還原型谷胱甘肽的濃度（20-40 mM）；
● 洗脫緩沖液PH過低：提高PH至8-9可促進洗脫；提高洗脫液中的離子強度（適當增加0.1-0.2 M NaCl）；適當加入DTT（1-10 mM）抑制還原型谷胱甘肽被氧化；
● 目標蛋白和填料間發生非特異相互作用：在洗脫緩沖液中加入非離子型去垢劑（例如0.1% Triton X-100）；

2、蛋白純度不高，雜帶較多
問題描述：收集液中有目標蛋白，但同時也有很多雜蛋白。這種情況一般發生在使用His標簽時，以下主要對His標簽蛋白純化進行講解。
問題自查1：是否目標蛋白本身表達不高，而雜蛋白表達較高；按照問題1中的方法檢測目標蛋白表達；
實驗優化1：優化質粒構建和蛋白表達的步驟；

問題自查2：蛋白是否容易降解？
在SDS-PAGE膠上觀察雜帶的分子量；如果雜帶的分子量比目標蛋白分子量小，且相差值約為幾個結構域或特定酶切位點，說明可能該雜帶是由目標蛋白降解產生的。

實驗優化2：
在裂解液和緩沖液中添加蛋白酶抑制劑（EDTA除外）；整個實驗保持在低溫下進行；盡量縮短前期樣品處理的時間；使用Cytiva帶有預過濾濾膜的HisTrap FF Crude柱子（貨號29048631），樣品無需過濾直接上樣，減少前期處理時間。

其他實驗優化：
● 雜蛋白對填料也有較強的結合：優化結合，洗脫條件；增加后續其他的純化步驟（離子交換，凝膠過濾等）；替換其他的標簽；構建雙標簽目標蛋白；嘗試使用其他的金屬離子（例如Co2+，貨號29048565）;
● 雜蛋白與目標蛋白存在非特異結合：裂解液和緩沖液中添加去垢劑（2% Triton X-100/Tween 20）；或添加甘油（20%以內）；增加緩沖液中NaCl濃度至500 mM；
● 洗雜過程優化：在結合緩沖液中添加10-20 mM咪唑；重復洗雜的步驟；
● 梯度洗脫：使用咪唑梯度濃度洗脫；

3、柱子堵了
問題描述：柱子發生堵塞，流速降低，壓力增高；此時需要根據說明書對層析柱進行清洗。
問題自查1：樣品和緩沖液上樣前有沒有過濾？
實驗優化1：收集到蛋白樣品之后，建議先用超聲破碎，然后離心取上清，然后使用0.45um或者0.2um的濾膜進行過濾；
問題自查2：是否樣品濃度或者粘性過高？
實驗優化2：可以適當稀釋樣品；如果樣品粘性比較高，也可能是樣品中含有高濃度的宿主核酸，可以增加超聲時間，或者加入核酸酶（5 ug/ml DNase1,1 mM Mg2+）進行處理。
問題自查3：層析柱有沒有定期清洗？
實驗優化：層析柱在使用5-10次之后，建議對層析柱進行常規清洗。清洗方法可以參考說明書。

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