雙特異性抗體（BsAb）的結構和結合活性傳統表征方法優缺點

BsAb簡介
1960年，美國Nisonoff課題組首次提出雙特異性抗體（BsAb）的概念。作為一種通過細胞融合、重組DNA或蛋白質工程技術構建的人工抗體，BsAb能同時結合兩種不同抗原，展現出比單克隆抗體（mAb）或聯合療法更卓越的治療潛力。

目前，全球已有22款BsAb藥物獲批上市，主要集中在腫瘤領域。2024年全球BsAb市場規模約130億美元，預計到2032年將爆發式增長至2246億美元。僅2025年上半年，中國BsAb License-out交易總額就高達92.57億美元，CD3靶向的TCE雙抗、PD-1/VEGF雙抗等成為熱門布局方向。

表1. 中國近年BsAb交易事件（部分）

在結構上，BsAb可分為IgG樣和片段型兩大類；其作用機制多樣，包括細胞橋接、受體橋聯、介導復合物形成及“歸巢”型，極大拓展了治療應用的邊界。

圖1. 雙特性抗體結構示例（doi: 10.3390/ijms22105350.）

圖2. BsAb作用機制示意圖（doi: 10.3390/ijms22105350.）

BsAb結合活性表征方法
雙抗結合活性的檢測絕非兩個單抗檢測的簡單疊加。它是一個需要精心設計、相互驗證的系統工程，旨在確保雙抗分子不僅能結合兩個靶點，而且是以正確的結構、恰當的比例和期望的方式同時結合，從而驅動其預期的生物學功能。因此，無論是在檢測方法的開發、驗證還是在整個質控流程中，其復雜性和挑戰性都遠高于單抗。傳統表征方法，如酶聯免疫吸附測定（ELISA）和表面等離子共振（SPR），雖技術成熟，但在BsAb的應用中存在明顯瓶頸：固相界面效應、難以模擬協同結合、操作繁瑣、通量有限。

表2. 雙特異性抗體結合活性傳統表征方法

瑞孚迪（Revvity）的Alpha與HTRF均相檢測技術為BsAb的高通量篩選與質控提供了高效解決方案，憑借其卓越的信噪比、操作簡便性、高重復性及更貼近生理狀態的溶液相反應環境輕松克服傳統方法的局限性，尤其適用于弱親和力相互作用的檢測，顯著加速BsAb的開發與穩定性評價進程。

Alpha/HTRF技術原理
Alpha技術是基于供體微珠和受體微珠間的近距離放大的化學發光反應，HTRF技術是基于銪或鋱的穴狀化合物（供體）與XL665或d2（受體）之間的時間分辨熒光共振能量轉移，兩者均基于均相檢測技術原理，即所有組分在溶液中自由反應并直接讀數，無需洗滌步驟。

圖3. Alpha/HTRF原理示意圖

Alpha/HTRF檢測模型
不同結構類型的BsAb都可以使用HTRF/Alpha技術來表征結合活性，以IgG樣BsAb為例，其結合活性可通過帶有不同標簽的抗原（如生物素化抗原與His標簽化抗原）及相應標簽抗體的toolbox試劑進行評價。

表2. Alpha/HTRF檢測模型示意圖和實驗流程

Alpha/HTRF技術優勢

• 高度模擬天然狀態：
  均相反應，避免固相化帶來的構象改變問題，能更真實地反映結合活性。
• 適用于協同結合檢測：
  其信號產生機制要求雙抗同時結合兩個靶點，可直接、高效地定量評估BsAb的雙特異性功能活性，而非簡單的單價結合。
• 卓越的弱結合檢測能力：
  其均相體系與高信噪比特性，能有效捕捉低親和力的微弱結合事件，精準解析BsAb與靶點間的弱相互作用（低至pmol-μmol級）。
• 高通量與高效率：
  免洗操作步驟大幅簡化流程和減少誤差，檢測流程約2-3 h，易于實現自動化，適合大規模篩選和常規放行測試。
• 高靈敏度與低樣本消耗：
  優異的信噪比，僅使用極少的樣本量（約2~5 μl）便可輕松檢測BsAb的結合。
• 操作便捷：
  整個操作過程僅需添加試劑、孵育讀數即可定量或檢測BsAb結合活性。

案例分享
1.使用Alpha/HTRF技術，BsAb結合活性既可通過設置不同的結合實驗獲得BsAb結合活性的EC50值（三元復合物-夾心法，圖4,5），或BsAb篩選的IC50值（競爭法，圖6），其靈活的檢測模型滿足了客戶對BsAb結合活性驗證的個性化要求。

圖4. 抗mTIGIT/mPD-L1和抗mCD200/mCD47 BsAb檢測模型

圖5. 抗mTIGIT/mPD-L1和抗mCD200/mCD47 BsAb的結合量效

圖6. 使用未標記目標蛋白的競爭法結果

2.瑞孚迪基于AlphaPlex™技術，使用不同熒光微球（Eu/Tb），通過捕獲不同的發射波長區分Eu/Tb微球信號，可在同一反應中同時檢測BsAb與兩個不同靶點的結合。AstraZeneca開發的BsAb AlphaPlex方法在50~150%線性范圍內表現出99%~107%的準確率，并檢測到光應激和熱應激條件下>50%的結合降解。此方法適用于BsAb的先導分子篩選、PK/PD分析、臨床相容性、商業批次放行和穩定性測試等。

圖7. AstraZeneca的BsAb binding檢測模型、穩定性研究和方法學驗證（doi: 10.1016/j.jim.2021.113099.）

3.瑞孚迪基于AlphaLISA™技術，BsAb在37℃下孵育12天后，檢測到BsAb的結合活性受到了影響；基于AlphaPlex™技術，進一步揭示了BsAb在37℃下，BsAb與PD-L1的結合是穩定的，但與TIGIT的結合能力則受到了影響。AlphaPlex™特別適用于分析某個靶點的結合能力是否受損。

圖8. BsAb強制降解研究

4.在某些雙特異性抗體中，可能存在與抗原結合親和力較低的情況。例如，為降低毒性效應，部分T細胞銜接器（TCE）類藥物會通過工程化改造降低其與CD3的結合強度。若采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）進行檢測，洗滌步驟易導致此類低親和力結合復合物的解離，從而無法有效捕獲信號或CV值較大。而瑞孚迪的Alpha/HTRF平臺作為一種均相檢測技術，無需洗滌步驟，可在溶液相中直接檢測低至微摩爾（μM）級別的弱分子互作，顯著提高對低親和力結合事件的檢測靈敏度。

圖9. 低親和力分子互作案例（doi: 10.1021/acschembio.6b00286.）