炎性caspases-1的結構、作用機制及WB檢測時的注意事項
介紹
caspases在細胞焦亡、細胞因子成熟和分泌中的作用是典型的促炎過程。在炎性caspases中，控制caspase-1活性的機制是最典型的。
經典炎癥小體內的caspase-1裂解其底物（pro-IL-1β, pro-IL-18, pro-IL-37, GSDMD），從而觸發細胞焦亡并通過炎癥介質發出信號，以抵抗病原微生物感染和激活免疫。
游離于細胞質中的caspase-1以單體形式存在，它需要二聚化才能獲得基本蛋白酶活性，進而催化自裂解，獲得裂解非自身底物的酶活性。
炎性caspases結構
炎性caspases具有相似的結構域。
N端是由caspase激活和招募結構域（CARD）組成，使其能夠被招募到炎癥小體；催化結構域是由大亞基(P17-20)、小亞基(P10-12)及連接大小亞基的連接區（IDL）組成；CARD通過一個CARD域連接子（CDL）與蛋白酶域相連。
大多數經典炎癥小體（AIM2、PYRIN、NLRP3、NLRP6、人NLRP1）需要ASC作為接頭蛋白來向caspase-1發出信號。炎癥小體中ASC有助于caspase-1 的IDL自激活。
WB做caspase-1需要注意哪些事項？
1、細胞類型
研究表明，caspase-1 CDL的裂解在不同類型的細胞之間受到差異調節，以調控caspase-1活性的持續性和隨后的細胞反應。經典炎癥小體發出信號刺激巨噬細胞會迅速死亡，而中性粒細胞則不會發生凋亡。
巨噬細胞中NLRP3誘導的caspase-1活性迅速發生，導致GSDMD和pro-IL-1β在細胞刺激后30分鐘內快速裂解，然后caspase-1活性消失，隨后發生細胞焦亡。在這個過程中，caspase-1活性物主要是p33/p10，在一小時內CDL裂解生成p20/p10終止酶活性。
NLRP3激活的中性粒細胞表現出較弱且長效的caspase-1活性（刺激后超過8小時），由p46和p33/p10二聚體介導，產生IL-1β的效率低于巨噬細胞，但可以在較長時間內產生IL-1β。
對caspase-1活性的動力學研究有助于實驗設計。只有在caspase-1二聚形成活性位點后，caspase-1的靶向藥才能與caspase-1相互作用以關閉蛋白酶活性。
在caspase-1快速失活的信號細胞中（如巨噬細胞），caspase-1底物在僅持續幾分鐘的爆發后被裂解，這會快速生成大量的GSDMD-p30，迅速在膜中形成孔，導致細胞溶解。caspase-1活性位點抑制劑通過終止炎癥信號以提供治療的作用有限。
而在信號持續數小時的細胞中（如中性粒細胞），caspase-1底物（如GSDMD）在數小時內緩慢裂解，caspase-1的靶向藥可通過其他機制修復膜孔、避免細胞焦亡發生。
2、適當刺激
細胞中caspase-1濃度較低，需要將caspase-1募集到炎癥小體才能促進其二聚化和激活。隨后CDL中的裂解導致caspase-1從炎癥小體中解離，并使游離的p20/p10 caspase-1二聚體不穩定。
體外表達的重組caspase-1 p20/p10不需要炎癥小體來獲得活性，且具有較強的蛋白酶活性。在這里，caspase-1以高濃度存在，大大超過正常細胞表達水平，這種高濃度單體促使二聚化發生，而不產生炎癥小體，并保持二聚體穩定性。
3、培養基檢測
細心的朋友會發現在圖2中已經有展示，p20在細胞裂解液和培養基中檢測結果有明顯差異，而p10僅在培養基中被檢測到，是由蛋白本身的性質決定的。
Cleaved Caspase-1（p10）蛋白在細胞裂解液中的含量本身較少，建議用細胞上清濃縮液做WB，具體步驟如下：
❖將培養基與2倍體積的冷丙酮混合，并在-20℃下放置過夜。
❖在4℃下以12，000g離心10分鐘。
❖小心去除上清液，注意不要移出蛋白質沉淀。
❖不要過度干燥沉淀，否則它可能無法完全溶解。
❖將沉淀重新懸浮在適當體積(100-500 μl)的1X SDS樣品緩沖液中。
❖WB檢測。
4、其他
❖裂解樣本的時候要超聲,使目的蛋白溶出更加充分。
❖保證足夠的蛋白上樣量,組織樣本推薦50~100μg,細胞樣本推薦20~50μg。
❖Caspase-1剪切體分子量較小，建議使用0.22μm膜，轉膜不能太久,避免過度轉膜。
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參考文獻：
1. Ross, Connie et al. “Inflammatory Caspases: Toward a Unified Model for Caspase Activation by Inflammasomes.” Annual review of immunology vol. 40 (2022): 249-269. doi:10.1146/annurev-immunol-101220-030653
2. Boucher, Dave et al. “Caspase-1 self-cleavage is an intrinsic mechanism to terminate inflammasome activity.” The Journal of experimental medicine vol. 215,3 (2018): 827-840. doi:10.1084/jem.20172222
3. Ball, Daniel P et al. “Caspase-1 interdomain linker cleavage is required for pyroptosis.” Life science alliance vol. 3,3 e202000664. 12 Feb. 2020, doi:10.26508/lsa.202000664
4. Schroder, Kate, and Jurg Tschopp. “The inflammasomes.” Cell vol. 140,6 (2010): 821-32. doi:10.1016/j.cell.2010.01.040
