間歇性壓縮力通過 Yes 相關(guān)蛋白調(diào)控人牙周膜細(xì)胞行為
Intermittent compressive force regulates human periodontal ligament cell behavior via yes-associated protein
Keywords: Cell fate decision, FTIR, Hippo signaling pathway, Human periodontal ligament cells, Intermittent compressive force, Yes-associated protein
機械調(diào)控通過機械感知和機械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程影響干細(xì)胞命運分化，其關(guān)鍵在于細(xì)胞對物理和機械信號（如 ECM 硬度、外在力等）的響應(yīng)。研究表明，ECM 硬度和機械力可通過影響整合素聚集、黏著斑形成、細(xì)胞骨架蛋白（如 F - 肌動蛋白）及相關(guān)信號通路（如 Rho GTP 酶），調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的命運決定（如成骨分化）。而這一調(diào)控過程的具體表現(xiàn)，與力的模式及細(xì)胞類型相關(guān)。
牙周膜作為連接牙齒與牙槽骨的特殊結(jié)締組織，在機械力傳遞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究通過多種加載模型發(fā)現(xiàn)，不同類型的機械力（如持續(xù)壓縮力、周期性張力等）會使人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生不同的機械生物學(xué)反應(yīng)。其中，間歇性壓縮力可通過調(diào)控牙周膜細(xì)胞活性維持牙周組織穩(wěn)態(tài)，具體表現(xiàn)為：作為機械傳感器，通過 IL-1β 刺激 RANKL 激活骨重塑；通過 TGF-β1 信號通路促進(jìn) SOST 和 POSTN 表達(dá)，助力牙周組織重塑。
YAP 和 TAZ 作為 Hippo 信號通路的下游介質(zhì)，通過經(jīng)典通路（受 Hippo 核心激酶負(fù)調(diào)控，影響細(xì)胞增殖）和非經(jīng)典通路（響應(yīng)機械信號，通過細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)）參與細(xì)胞功能及組織生長調(diào)控。在牙組織中，YAP 在牙上皮和口腔間充質(zhì)中表達(dá)，其異常（過表達(dá)或敲除）會影響牙齒形態(tài)發(fā)生、牙胚發(fā)育及細(xì)胞增殖，提示 YAP 在牙齒形成及牙周組織等周圍間充質(zhì)組織中具有關(guān)鍵作用。YAP 在骨穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，可通過促進(jìn)成骨分化、抑制成脂分化維持骨量，例如能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂潛能，且對人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨與成脂分化有調(diào)控作用，在周期性強度加載下還能促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞成骨分化。但目前，關(guān)于壓縮力作用下 YAP 對人牙周膜細(xì)胞命運決定的影響仍有待研究。
基于此，朱拉隆功大學(xué)牙科學(xué)院再生牙科學(xué)卓越中心及解剖學(xué)系的研究團(tuán)隊探究了人牙周膜細(xì)胞是否通過 Hippo-YAP 通路響應(yīng)間歇性壓縮力，并分析 YAP 敲低在此條件下對細(xì)胞增殖和命運決定的影響。研究成果發(fā)表在Heliyon期刊，題為“Intermittent compressive force regulates human periodontal ligament cell behavior via yes-associated protein”。
首先，為確定壓縮力對人牙周膜細(xì)胞中 YAP 的影響，研究人員檢測了間歇性壓縮力（ICF）和持續(xù)性壓縮力（CCF）加載后 YAP 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：ICF 會誘導(dǎo) YAP 核轉(zhuǎn)位（圖 1B），使 YAP 活性形式增加（圖 1B）、非活性形式（p-YAP）減少（圖 1D），即ICF 可促進(jìn) YAP 的表達(dá)及活性。而 CCF 則產(chǎn)生相反效果，會降低 YAP 活性、 增加其非活性形式。
圖1 壓縮力加載下人牙周膜細(xì)胞中 YAP 的表達(dá)。
為了探究牙周膜細(xì)胞是否通過 YAP 信號級聯(lián)響應(yīng)ICF ，研究人員構(gòu)建了 YAP 敲除（YAP-KD）的牙周膜細(xì)胞及對照細(xì)胞，施加 ICF 24 小時后檢測相關(guān)基因表達(dá)。通過蛋白質(zhì)印跡法 證實 YAP 蛋白的表達(dá)受到抑制（圖 2A）。結(jié)果顯示，YAP 缺失不影響細(xì)胞活力和凋亡。ICF 處理使對照組中 YAP1 及其下游靶基因（CYCLIN-D1、C-MYC ）表達(dá)顯著上調(diào)（圖 2B、C），而 YAP-KD 組及 YAP-KD ICF 組中YAP、CYCLIN-D1、C-MYC 和 CTGF 的 mRNA 表達(dá)水平下調(diào) ，但 YAP-KD ICF 組表達(dá)仍高于單純 YAP-KD 組。這表明 ICF 可激活 YAP 轉(zhuǎn)錄活性，且 YAP 作為機械感知蛋白能將 ICF 信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞變化。
圖2 ICF 加載下，YAP 敲除的牙周膜細(xì)胞中 YAP 及其下游靶基因的 mRNA 表達(dá)。
隨后，為了探究壓縮力對人牙周膜細(xì)胞增殖的影響，研究人員檢測了 ICF 和 CCF 處理后細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，ICF 顯著上調(diào) LIN28a、LIN28b、OCT4、REX1、SOX2 和 KI67 等增殖相關(guān)基因的 mRNA 表達(dá)，而 CCF 無此效果（圖 3A），表明壓縮力對增殖相關(guān)基因的影響與載荷類型相關(guān)。在 ICF 條件下，YAP 敲除細(xì)胞中上述基因表達(dá)顯著降低（圖 3B），且這一結(jié)果與使用 YAP 抑制劑的情況一致。免疫熒光分析也顯示，ICF 可提高 KI67 陽性細(xì)胞比例，而 YAP 缺失會降低該比例（無論是否施加 ICF）（圖 3C、D）。
接下來，研究人員通過體外傷口愈合實驗探究了ICF是否通過 YAP 的表達(dá)影響人牙周膜細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示，對照組在 48 小時后傷口幾乎閉合（圖 4A），而 YAP 敲除且經(jīng) ICF 處理的細(xì)胞傷口縮減比例低于 ICF 處理的對照組（圖 4B），經(jīng) YAP 抑制劑 DH 處理的細(xì)胞也呈現(xiàn)類似結(jié)果。這表明 ICF 通過 YAP 信號影響人牙周膜細(xì)胞增殖，YAP 缺失會導(dǎo)致其靶基因轉(zhuǎn)錄活性降低、傷口閉合延遲。
圖4 在 ICF 加載下，YAP 沉默降低人牙周膜細(xì)胞的增殖能力。
接著，為探究 ICF 是否通過 YAP 信號影響人牙周膜細(xì)胞成骨分化，研究人員對 YAP-KD 細(xì)胞施加 ICF 24h后進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，YAP-KD 且經(jīng) ICF 處理的細(xì)胞中， 成骨特異性標(biāo)志物OCN 和 COL1A1的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（圖 5A）。ICF 誘導(dǎo)的細(xì)胞中 COL1 蛋白水平升高，而 YAP-KD 細(xì)胞（無論是否經(jīng) ICF 處理）中 COL1 蛋白水平均降低（圖 5B）。ALP 活性染色顯示 YAP-KD ICF 細(xì)胞成骨分化能力低于對照組。茜素紅 S 染色表明 Control ICF 組礦化骨基質(zhì)分泌增加，而 YAP 抑制會顯著減少礦化物沉積（無論是否施加 ICF）（圖 5C）。
為了進(jìn)一步探究了ICF是否通過 YAP 的表達(dá)影響人牙周膜細(xì)胞的成脂分化能力 ，研究人員對 YAP-KD 細(xì)胞進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)。21 天后發(fā)現(xiàn)，YAP-KD 組和 YAP-KD ICF 組成脂特異性標(biāo)志物（PPARG、ADIPOQ）的 mRNA 表達(dá)較各自對照組顯著上調(diào)，而對照組與 Control ICF 組間無顯著差異（圖 6A），表明 YAP 缺失會促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞成脂分化，而 ICF 本身對成脂分化無顯著影響。 油紅 O 染色結(jié)果顯示，在YAP-KD 細(xì)胞中含脂滴的細(xì)胞積累增多。對正常牙周膜細(xì)胞施加 ICF 可間接上調(diào) YAP 活性，顯著減少脂滴形成（圖 6B-C）。此外，YAP-KD 組與 YAP-KD ICF 組的脂滴積累量無顯著差異，且 YAP-KD ICF 組脂滴仍多于 Control ICF 組，表明牙周膜細(xì)胞中 YAP 缺失會使其對機械力失去響應(yīng)。
最后，為證實 YAP 是重要的機械感知信號分子，研究人員通過同步輻射 FTIR 分析檢測了細(xì)胞整體生物分子變化。結(jié)果顯示，在類似 ICF 的培養(yǎng)條件下，YAP-KD ICF 組與 Control ICF 組相比，整體生物分子結(jié)構(gòu)明顯改變，脂質(zhì)水平更高（圖 7A-C）。PCA 得分圖顯示兩組細(xì)胞明顯分離（圖 7D-E）。這一結(jié)果表明 YAP 是調(diào)控人牙周膜細(xì)胞成脂分化的重要信號分子。此外，對 YAP 缺失細(xì)胞施加 ICF 無法完全恢復(fù)對照組表型。
總之，研究表明，牙周膜細(xì)胞中的 YAP 作為機械感知蛋白調(diào)控細(xì)胞分化：間歇性壓縮力誘導(dǎo) YAP 表達(dá)，促使細(xì)胞向成骨分化；而 YAP 缺失則使細(xì)胞傾向于成脂分化，這解釋了機械負(fù)荷對預(yù)防牙槽骨丟失的重要性。綜上，YAP 作為機械敏感調(diào)節(jié)因子，在人牙周膜細(xì)胞增殖及命運決定中起必要作用（圖8）。
參考文獻(xiàn)：Klincumhom N, Lorthongpanich C, Thumanu K, Septham P, Phomyu W, Issaragrisil S, Pavasant P. Intermittent compressive force regulates human periodontal ligament cell behavior via yes-associated protein. Heliyon. 2022 Oct 1;8(10):e10845. doi: 10.1016/j.heliyon.2022.e10845. PMID: 36247165; PMCID: PMC9561743.
原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9561743/
Impact Factor: 3.6
ISSN: 2405-8440
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻(xiàn)
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注！進(jìn)入官網(wǎng)www.naturethink.com或關(guān)注“Naturethink”公眾號，了解更多相關(guān)內(nèi)容。
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Keywords: Cell fate decision, FTIR, Hippo signaling pathway, Human periodontal ligament cells, Intermittent compressive force, Yes-associated protein
機械調(diào)控通過機械感知和機械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程影響干細(xì)胞命運分化，其關(guān)鍵在于細(xì)胞對物理和機械信號（如 ECM 硬度、外在力等）的響應(yīng)。研究表明，ECM 硬度和機械力可通過影響整合素聚集、黏著斑形成、細(xì)胞骨架蛋白（如 F - 肌動蛋白）及相關(guān)信號通路（如 Rho GTP 酶），調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的命運決定（如成骨分化）。而這一調(diào)控過程的具體表現(xiàn)，與力的模式及細(xì)胞類型相關(guān)。
牙周膜作為連接牙齒與牙槽骨的特殊結(jié)締組織，在機械力傳遞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究通過多種加載模型發(fā)現(xiàn)，不同類型的機械力（如持續(xù)壓縮力、周期性張力等）會使人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生不同的機械生物學(xué)反應(yīng)。其中，間歇性壓縮力可通過調(diào)控牙周膜細(xì)胞活性維持牙周組織穩(wěn)態(tài)，具體表現(xiàn)為：作為機械傳感器，通過 IL-1β 刺激 RANKL 激活骨重塑；通過 TGF-β1 信號通路促進(jìn) SOST 和 POSTN 表達(dá)，助力牙周組織重塑。
YAP 和 TAZ 作為 Hippo 信號通路的下游介質(zhì)，通過經(jīng)典通路（受 Hippo 核心激酶負(fù)調(diào)控，影響細(xì)胞增殖）和非經(jīng)典通路（響應(yīng)機械信號，通過細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)）參與細(xì)胞功能及組織生長調(diào)控。在牙組織中，YAP 在牙上皮和口腔間充質(zhì)中表達(dá)，其異常（過表達(dá)或敲除）會影響牙齒形態(tài)發(fā)生、牙胚發(fā)育及細(xì)胞增殖，提示 YAP 在牙齒形成及牙周組織等周圍間充質(zhì)組織中具有關(guān)鍵作用。YAP 在骨穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，可通過促進(jìn)成骨分化、抑制成脂分化維持骨量，例如能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂潛能，且對人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨與成脂分化有調(diào)控作用，在周期性強度加載下還能促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞成骨分化。但目前，關(guān)于壓縮力作用下 YAP 對人牙周膜細(xì)胞命運決定的影響仍有待研究。
基于此，朱拉隆功大學(xué)牙科學(xué)院再生牙科學(xué)卓越中心及解剖學(xué)系的研究團(tuán)隊探究了人牙周膜細(xì)胞是否通過 Hippo-YAP 通路響應(yīng)間歇性壓縮力，并分析 YAP 敲低在此條件下對細(xì)胞增殖和命運決定的影響。研究成果發(fā)表在Heliyon期刊，題為“Intermittent compressive force regulates human periodontal ligament cell behavior via yes-associated protein”。
圖1 壓縮力加載下人牙周膜細(xì)胞中 YAP 的表達(dá)。 圖2 ICF 加載下，YAP 敲除的牙周膜細(xì)胞中 YAP 及其下游靶基因的 mRNA 表達(dá)。 隨后，為了探究壓縮力對人牙周膜細(xì)胞增殖的影響，研究人員檢測了 ICF 和 CCF 處理后細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，ICF 顯著上調(diào) LIN28a、LIN28b、OCT4、REX1、SOX2 和 KI67 等增殖相關(guān)基因的 mRNA 表達(dá)，而 CCF 無此效果（圖 3A），表明壓縮力對增殖相關(guān)基因的影響與載荷類型相關(guān)。在 ICF 條件下，YAP 敲除細(xì)胞中上述基因表達(dá)顯著降低（圖 3B），且這一結(jié)果與使用 YAP 抑制劑的情況一致。免疫熒光分析也顯示，ICF 可提高 KI67 陽性細(xì)胞比例，而 YAP 缺失會降低該比例（無論是否施加 ICF）（圖 3C、D）。
圖3 在 ICF 加載下，YAP-KD 細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志物的 mRNA 表達(dá)水平。
接下來，研究人員通過體外傷口愈合實驗探究了ICF是否通過 YAP 的表達(dá)影響人牙周膜細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示，對照組在 48 小時后傷口幾乎閉合（圖 4A），而 YAP 敲除且經(jīng) ICF 處理的細(xì)胞傷口縮減比例低于 ICF 處理的對照組（圖 4B），經(jīng) YAP 抑制劑 DH 處理的細(xì)胞也呈現(xiàn)類似結(jié)果。這表明 ICF 通過 YAP 信號影響人牙周膜細(xì)胞增殖，YAP 缺失會導(dǎo)致其靶基因轉(zhuǎn)錄活性降低、傷口閉合延遲。
圖4 在 ICF 加載下，YAP 沉默降低人牙周膜細(xì)胞的增殖能力。 接著，為探究 ICF 是否通過 YAP 信號影響人牙周膜細(xì)胞成骨分化，研究人員對 YAP-KD 細(xì)胞施加 ICF 24h后進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，YAP-KD 且經(jīng) ICF 處理的細(xì)胞中， 成骨特異性標(biāo)志物OCN 和 COL1A1的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（圖 5A）。ICF 誘導(dǎo)的細(xì)胞中 COL1 蛋白水平升高，而 YAP-KD 細(xì)胞（無論是否經(jīng) ICF 處理）中 COL1 蛋白水平均降低（圖 5B）。ALP 活性染色顯示 YAP-KD ICF 細(xì)胞成骨分化能力低于對照組。茜素紅 S 染色表明 Control ICF 組礦化骨基質(zhì)分泌增加，而 YAP 抑制會顯著減少礦化物沉積（無論是否施加 ICF）（圖 5C）。
圖5 在 ICF 加載下，YAP 的抑制會阻礙人牙周膜細(xì)胞的成骨分化。
為了進(jìn)一步探究了ICF是否通過 YAP 的表達(dá)影響人牙周膜細(xì)胞的成脂分化能力 ，研究人員對 YAP-KD 細(xì)胞進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)。21 天后發(fā)現(xiàn)，YAP-KD 組和 YAP-KD ICF 組成脂特異性標(biāo)志物（PPARG、ADIPOQ）的 mRNA 表達(dá)較各自對照組顯著上調(diào)，而對照組與 Control ICF 組間無顯著差異（圖 6A），表明 YAP 缺失會促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞成脂分化，而 ICF 本身對成脂分化無顯著影響。 油紅 O 染色結(jié)果顯示，在YAP-KD 細(xì)胞中含脂滴的細(xì)胞積累增多。對正常牙周膜細(xì)胞施加 ICF 可間接上調(diào) YAP 活性，顯著減少脂滴形成（圖 6B-C）。此外，YAP-KD 組與 YAP-KD ICF 組的脂滴積累量無顯著差異，且 YAP-KD ICF 組脂滴仍多于 Control ICF 組，表明牙周膜細(xì)胞中 YAP 缺失會使其對機械力失去響應(yīng)。
圖6 在 ICF 加載下，YAP 的抑制會促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的成脂分化。
最后，為證實 YAP 是重要的機械感知信號分子，研究人員通過同步輻射 FTIR 分析檢測了細(xì)胞整體生物分子變化。結(jié)果顯示，在類似 ICF 的培養(yǎng)條件下，YAP-KD ICF 組與 Control ICF 組相比，整體生物分子結(jié)構(gòu)明顯改變，脂質(zhì)水平更高（圖 7A-C）。PCA 得分圖顯示兩組細(xì)胞明顯分離（圖 7D-E）。這一結(jié)果表明 YAP 是調(diào)控人牙周膜細(xì)胞成脂分化的重要信號分子。此外，對 YAP 缺失細(xì)胞施加 ICF 無法完全恢復(fù)對照組表型。
圖7 在 ICF 加載下，分化的 YAP-KD 細(xì)胞呈現(xiàn)成脂表型。
圖8 人牙周膜細(xì)胞通過 YAP 信號響應(yīng) ICF 的行為示意圖。
總之，研究表明，牙周膜細(xì)胞中的 YAP 作為機械感知蛋白調(diào)控細(xì)胞分化：間歇性壓縮力誘導(dǎo) YAP 表達(dá)，促使細(xì)胞向成骨分化；而 YAP 缺失則使細(xì)胞傾向于成脂分化，這解釋了機械負(fù)荷對預(yù)防牙槽骨丟失的重要性。綜上，YAP 作為機械敏感調(diào)節(jié)因子，在人牙周膜細(xì)胞增殖及命運決定中起必要作用（圖8）。
參考文獻(xiàn)：Klincumhom N, Lorthongpanich C, Thumanu K, Septham P, Phomyu W, Issaragrisil S, Pavasant P. Intermittent compressive force regulates human periodontal ligament cell behavior via yes-associated protein. Heliyon. 2022 Oct 1;8(10):e10845. doi: 10.1016/j.heliyon.2022.e10845. PMID: 36247165; PMCID: PMC9561743.
原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9561743/
Impact Factor: 3.6
ISSN: 2405-8440
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻(xiàn)
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注！進(jìn)入官網(wǎng)www.naturethink.com或關(guān)注“Naturethink”公眾號，了解更多相關(guān)內(nèi)容。
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