利用密度梯度離心分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法及步驟

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今天為大家介紹使用密度梯度離心的方法（Ficoll,Percoll）分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的策略。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs簡(jiǎn)介
1869年，Ashworth,T.R等^【1】首次在一例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者血液中觀察到循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）。CTCs即是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞^【2】，如圖1。

圖1：循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs進(jìn)入血液循環(huán)

原發(fā)腫瘤釋放CTCs進(jìn)入循環(huán)中，大部分CTCs死亡，但是少部分CTCs存活并在遠(yuǎn)端形成轉(zhuǎn)移灶^【9】。

每天每g原位瘤可能會(huì)釋放多達(dá)百萬(wàn)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)^【3】，但大部分因血流剪切力、失巢凋亡、免疫系統(tǒng)識(shí)別^【4】而被清除，只有極少數(shù)（0.01%）^{【4】【5】}存活下來(lái)，通過(guò)血液或淋巴到達(dá)遠(yuǎn)端器官形成新的轉(zhuǎn)移灶，是腫瘤轉(zhuǎn)移（Metastasis）和復(fù)發(fā)的重要生物學(xué)基礎(chǔ)之一。
因此，CTCs是腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的重要靶點(diǎn)^【6】，作為液體活檢（其它如cfDNA、cfRNA、microRNA、外泌體、腫瘤代謝物）重要組成之一，其完整細(xì)胞的特有屬性，允許通過(guò)表型、基因型（如單細(xì)胞測(cè)序）、細(xì)胞功能以及異種移植模型，用于腫瘤早期診斷、疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)檢測(cè)、轉(zhuǎn)移癌監(jiān)控、腫瘤亞型改變、耐藥性研究以及預(yù)后評(píng)估^【7】，促進(jìn)個(gè)體化治療實(shí)施。
此外，CTCs攜帶了腫瘤的基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等多組學(xué)信息，可用于研究腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移微環(huán)境PMN、免疫逃逸機(jī)制，還可用于培養(yǎng)類器官^【8】進(jìn)行體外藥物篩選和檢測(cè)。

CTCs的分離方法
CTCs的分離方法，主要分為非標(biāo)記法和標(biāo)記法，如圖2。

圖2：CTCs分離、培養(yǎng)和分析方法^【10】

非標(biāo)記法
主要依賴CTCs自身的物理性質(zhì)，如大小、密度、粘附、介電性質(zhì)和變形性^{【11】【12】}。被廣泛使用的Cytiva Ficoll-Paque 和Percoll分離液即基于密度分離。大小和變形性等則常用于微流控技術(shù)^【13】。

標(biāo)記法
主要為陽(yáng)性富集（如上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM^【14】、HER2、束絲蛋白3^【15】、前列腺特異性抗原PSA^【16】等或Cocktail）和陰性富集（如CD45抗體去除白細(xì)胞、CD61去除血小板和巨核細(xì)胞^【17】、CD14等或Cocktail）。
基于抗EpCAM免疫磁珠技術(shù)的CellSearch CTC Test方法，是目前唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為腫瘤預(yù)后評(píng)估工具用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌（2004年）^【18】、結(jié)直腸癌（2007年）^【19】和前列腺癌（2008年）^【20】。
中國(guó)CFDA在2012年批準(zhǔn)了CellSearch系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后評(píng)估。其它本土獲批產(chǎn)品包括CytoSorter循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)等，更多檢測(cè)方法也在興起和驗(yàn)證中。
CTCs的分離也可以聯(lián)合非標(biāo)記和標(biāo)記法^【21】，并受到腫瘤類型的影響^【17】。

但是，CTCs分離仍面臨挑戰(zhàn)：
腫瘤細(xì)胞本身即具有異質(zhì)性。并且，CTCs因上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）失去極性和黏附性，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，與基質(zhì)互作并抵抗治療，同時(shí)表現(xiàn)出上皮和間質(zhì)表型^【22】，也造成細(xì)胞表面Marker的動(dòng)態(tài)變化。此外，CTCs還會(huì)和血液中其它細(xì)胞如白細(xì)胞形成CTC微血栓促進(jìn)自身生存和轉(zhuǎn)移。
CTCs在血液中的密度很低，~1-10 CTCs/mL血液^【10】，分離富集挑戰(zhàn)大。一般，轉(zhuǎn)移性癌癥中每10 mL血液中有0-100個(gè)單體CTCs以及0-5個(gè)CTCs Cluster（CTCs簇），并與癌癥類型、血液收集位置以及治療階段有關(guān)^【23】。CTCs半衰期通常只有 1.0‑2.4 h^【24】。

使用密度梯度離心法分離CTCs
早在1959年，Seal SH等^【25】即使用硅油配制密度梯度離心介質(zhì)，分離血液中的游離腫瘤細(xì)胞。
目前，商品化的梯度介質(zhì)，如Cytiva的Ficoll-Paque進(jìn)行CTCs的分離，在臨床研究中被廣泛使用^{【21】【26】【27】【28】}。
作為非標(biāo)記的分離方法，利于富集表面Marker表達(dá)異質(zhì)性CTCs以及未知CTCs亞型，操作簡(jiǎn)單、低成本、快速，處理通量大。
使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs，文獻(xiàn)報(bào)道中主要包括4種方法：常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)操作、抗體預(yù)先結(jié)合雜質(zhì)細(xì)胞、抗體預(yù)先結(jié)合CTCs目的細(xì)胞，以及使用Percoll不連續(xù)密度梯度進(jìn)行分離。

使用Ficoll-Paque進(jìn)行CTCs分離的常規(guī)操作
根據(jù)斯托克斯定律，如圖3，顆粒的沉降速率v，和顆粒直徑（d）、樣品密度（ρ_p）和溶液密度（ρ_l）之差成正比；與溶液的粘稠度（η）成反比。當(dāng)不同細(xì)胞經(jīng)過(guò)同一密度離心介質(zhì)，不同顆粒直徑和密度的細(xì)胞，沉降速率不同，從而被分開。
外周血中，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞密度大^【38】如圖6，穿過(guò)Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)（1.077 g/mL）沉于底層；外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMCs和CTCs密度小，一起停留在白膜層（buffy coat）中，最上面是血漿。
后續(xù)可以使用陽(yáng)性富集^【29】或陰性富集（如anti-CD45磁珠去除白細(xì)胞）^{【30】【39】}進(jìn)一步回收CTCs。

圖3：顆粒沉降速率公式^【31】

抗體結(jié)合雜質(zhì)細(xì)胞后，再使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs
在密度梯度分離之前，進(jìn)行雜質(zhì)細(xì)胞預(yù)標(biāo)記，促進(jìn)其沉降。例如采用anti-CD45（白細(xì)胞共同抗原）^{【8】【32】【33】}、anti-66b（粒細(xì)胞）與樣品進(jìn)行孵育，使白細(xì)胞與紅細(xì)胞形成免疫玫瑰花狀結(jié)構(gòu)，密度和大小增加，在后續(xù)密度梯度離心過(guò)程中，將白細(xì)胞群拉到管底，則在白膜層可以回收更純的CTCs，如圖4，少量CTCs可能會(huì)滲漏到血漿層，也可以一起回收^{【6】【32】}。
相對(duì)于陽(yáng)性篩選，基于去除白細(xì)胞的陰性篩選更有優(yōu)勢(shì)，避免了使用抗體激活CTCs以及某些CTCs因?yàn)椴槐磉_(dá)相應(yīng)的抗原而被遺漏^【32】。

圖4：使用Ficoll-Paque 密度梯度介質(zhì)，分離CTCs

將血液和白細(xì)胞抗體如RosetteSep抗體孵育，使用DPBS+2% FBS稀釋血樣，然后小心地鋪到Ficoll-Paque 密度梯度介質(zhì)上面，離心（關(guān)閉剎車）后在白膜層收獲CTCs^【32】。

抗體結(jié)合目的CTCs后，再使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs
在密度梯度分離之前，進(jìn)行CTCs目的細(xì)胞預(yù)標(biāo)記，促進(jìn)其沉降。
Huang Q等^【34】使用同時(shí)偶聯(lián)anti‑EpCAM抗體和anti‑CD146抗體（后者作為腫瘤標(biāo)志物以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT誘導(dǎo)劑，利于捕獲EpCAM無(wú)/低表達(dá)間質(zhì)CTCs）的SiO2微珠（表面包被可降解明膠），先和血樣孵育以結(jié)合CTCs，之后將樣品鋪在Cytiva Percoll密度梯度介質(zhì)（配制成1.15 g/mL）的表面，離心，CTCs結(jié)合在微珠表面而沉降于管底，之后酶解表層明膠釋放CTCs，結(jié)果顯示CTCs收率＞80%，純度大于85%，如圖5。
也可以使用Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)，采用類似方法離心沉降CTCs目的細(xì)胞，收集管底組分并裂紅，回收CTCs。

圖5：基于微珠和密度梯度介質(zhì)進(jìn)行CTCs分離（部分圖片）

A：通過(guò)可降解明膠包被的微珠（偶聯(lián)了anti-EpCAM和anti-CD146抗體），高效吸附CTCs。
B：經(jīng)過(guò)Percoll密度梯度離心，將結(jié)合CTCs的二氧化硅微珠沉淀到管底，從而和血細(xì)胞分離。
C：通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9酶解明膠，釋放結(jié)合在微珠表面的CTCs。
除了CTCs單細(xì)胞外，CTC Cluster^【35】以及CTCs與其它血液成分組成的細(xì)胞團(tuán)，往往具有更高的轉(zhuǎn)移潛能。由于細(xì)胞團(tuán)的密度更大，容易在離心后沉降，也可以采用類似方法進(jìn)行分離，或使用Cluster-Chip^【36】。
另外，具有干性的CTCs，即循環(huán)癌干細(xì)胞（Circulating Cancer Stem Cells，CCSCs）同樣值得關(guān)注。

細(xì)胞分離液產(chǎn)品是經(jīng)典的無(wú)菌即開即用型密度梯度介質(zhì)，可以根據(jù)細(xì)胞密度的不同從樣品中分離出目標(biāo)細(xì)胞，具有高活性，高純度，高回收率等特點(diǎn)。

Ficoll Premium系列三款產(chǎn)品
Ficoll產(chǎn)品可以分為Ficoll-Paque Plus和Ficoll-Paque Premium兩大系列，Premium系列是在嚴(yán)格控制的環(huán)境下生產(chǎn)的（符合ISO 13485:2003，依從美國(guó)藥典章節(jié)<1043>的相關(guān)規(guī)定，具有法規(guī)支持文件 (RSF)），因此推薦可用作臨床研究和細(xì)胞治療，其成分與Ficoll-Paque plus沒有區(qū)別。
此外，F(xiàn)icoll-Paque premium產(chǎn)品具有1.077，1.084和1.073三種密度，為客戶提供更多的密度選擇。具體密度適用范圍參照下表：

產(chǎn)品選擇指南：

貨號(hào)	品名	規(guī)格	適用細(xì)胞類型
17144002	FICOLL PAQUE PLUS 1.077	6X100ML	人外周血，臍帶血，骨髓等樣品中分離單個(gè)核細(xì)胞
17144003	FICOLL PAQUE PLUS 1.077	6X500ML
17544202	FICOLL PAQUE PREMIUM 1.077	6X100ML
17544203	FICOLL PAQUE PREMIUM 1.077	6X500ML
17544602	Ficoll-Paque PREMIUM 1.084	6X100ML	大/小鼠血液,骨髓，組織中分離單個(gè)核細(xì)胞。
17544652	Ficoll-Paque PREMIUM 1.073	6X100ML	分離人低密度細(xì)胞，如基質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞。
17089102	PERCOLL	250ML	通用細(xì)胞分離，可稀釋成不同密度，可用來(lái)分離各種細(xì)胞及細(xì)胞器。如：中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，病毒等等。
17089109	PERCOLL	6X1L
17089109-1	PERCOLL	1L
17544502	Percol1 PLUS 250 ML	250ML
17544501	PERCOLL PLUS	1L

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