CircPRKD3/miR-6783-3p 響應機械力促進牽張狀態牙周膜干細胞成骨

CircPRKD3/miR-6783-3p responds to mechanical force to facilitate the osteogenesis of stretched periodontal ligament stem cells

Keywords: CircPRKD3, miR-6783-3p, ceRNAs, PDLSCs, Mechanical force

外在機械力介導牙槽骨組織重建時，牙周膜干細胞（PDLSCs）是機械力轉化為骨重塑生物信號的關鍵，其經牽張誘導分化為成骨細胞后，可通過調控破骨細胞影響骨重建方向，因此明確其在機械力下的成骨分化機制十分重要。

非編碼 RNA（ncRNAs）因在人類基因組中占比高且功能廣泛受到關注，在此前已明確 miR-21 和 lncRNA SNHG8-EZH2 軸對機械刺激下 PDLSCs 成骨的抑制作用。而環狀 RNA（circRNAs）因結構穩定成為新的研究重點，雖然機械力作用下環狀 RNA 的表達譜主要集中在轉錄、翻譯、能量代謝、細胞信號傳導及通訊等方面 ，但具體調控模式不明。鑒于環狀 RNA 可作為微小 RNA “海綿”，結合此前 miR-21 對 PDLSCs 成骨的調控研究，研究人員預測并驗證了與 miR-21 相關的環狀 RNA，發現 circPRKD3 在機械負荷下的 PDLSCs 中變化zui顯著。

CircPRKD3 是一種 943nt 的環狀 RNA，目前其功能尚未被研究報道。不過其親本基因 PRKD3 的相關功能已有較多發現：它在腫瘤發生時表達異常，是潛在癌基因；能影響肝硬化肝組織中巨噬細胞極化和轉化生長因子 β 生成；還參與 MMP1/13 調控的促炎過程，與軟骨基質降解、多核成熟破骨細胞分化相關，且關聯骨修復過程。

基于此，山東大學齊魯醫學院口腔醫學院的研究團隊通過對 PDLSCs 施加機械刺激，同時利用慢病毒構建體實現 circPRKD3 的敲低、利用質粒實現 circPRKD3 的過表達，以此研究 circPRKD3 在機械刺激條件下的成骨功能，并闡明其潛在的機械轉導機制。研究成果發表在Journal of orthopaedic surgery and research期刊，題為“CircPRKD3/miR-6783-3p responds to mechanical force to facilitate the osteogenesis of stretched periodontal ligament stem cells”。

首先，研究人員對分離的 PDLSCs 進行了鑒定并分析其生物學特性。形態上，分離得到的 PDLSCs 呈長梭形（圖 1A）。流式細胞術顯示其表達間充質干細胞表面標志物（包括 CD73、CD90、CD146 和 STRO-1 ），不表達造血干細胞標志物 CD34 和白細胞標志物 CD45 （圖 1B）。功能上，ALP染色結果顯示 ALP 活性升高（圖 1C、D）；茜素紅染色發現細胞外基質鈣化增強，這表明 PDLSCs 具有成骨分化能力（圖 1E、F）。這些結果表明該 PDLSCs 具備多向分化潛能，符合間充質干細胞的基本標準。

圖1    PDLSCs 的鑒定及生物學特性。

為了研究機械刺激對 PDLSCs 及 circPRKD3 的影響，研究人員對PDLSCs 施加牽張刺激。體外機械刺激的PDLSCs 示意圖如圖 2A 所示 。結果顯示，與未受牽張誘導、排列雜亂的 PDLSCs（圖 2B）相比，受到機械力作用的 PDLSCs 沿受力方向排列，形態呈牽張狀態（圖 2C），機械力的施加增強了 PDLSCs 的成骨潛能（圖 2E-I）。同時，機械刺激會使 circPRKD3 的表達上調（圖 2D），提示其可能參與牽張誘導的 PDLSCs 成骨過程。此外，通過數據庫查詢和結構分析發現，circPRKD3 存在特定剪接連接點（圖 2J），且具有最小自由能的 circPRKD3 預測出兩種結構（圖 2K-O），這表明 circPRKD3 的 RNA 二級結構具有多樣性。  
 

圖2    機械刺激的 PDLSCs 成骨發育過程中 circPRKD3 表達上調。

接著，研究了 circPRKD3 在機械刺激下 PDLSCs 成骨過程中的功能，研究人員選擇下調效果佳的序列靶點 57219-1，設計并合成了慢病毒載體（圖 3A）。后續的熒光成像（圖 3B）和 qRT-PCR （圖 3C） 分析結果證實，通過該病毒轉染能有效敲低 circPRKD3。為了明確下調 circPRKD3 對機械刺激下 PDLSCs 成骨分化潛能的影響，研究人員對陰性對照（sh-NC）和 circPRKD3 敲低（sh-circPRKD3）兩組 PDLSCs 施加 24 小時機械力刺激。結果顯示，circPRKD3 敲低后，成骨相關分子 ALP 和 RUNX2 在轉錄及翻譯水平的表達均顯著降低（圖 3D-3H），由此證實下調 circPRKD3 會抑制牽張誘導的 PDLSCs 成骨。

為了進一步明確 circPRKD3 的功能，研究人員在之前 circPRKD3 敲低實驗的基礎上開展了過表達實驗。通過擴增 circPRKD3 全長序列，利用EcoRI 和 BamHI 兩種限制酶將其連接到 pLC5-ciR 載體（圖 3I）。合成序列無雜峰和重疊條帶（圖 3I），表明 circPRKD3 的基因片段已成功插入 pLC5-ciR 載體。隨后將相關質粒保存于甘油菌中，借助氨芐青霉素篩選出含circPRKD3 過表達質粒的純凈大腸桿菌（圖 3K）。從大腸桿菌中提取質粒并驗證純度后，檢測circPRKD3 在 293T 細胞和 PDLSCs 中的過表達效率（圖 3L、M），發現 PDLSCs 轉染效率顯著低于 293T 細胞，推測與原代細胞和細胞系對轉染試劑的反應性差異有關。

然后，為了進一步探究 circPRKD3 的成骨作用，研究人員對陰性對照載體（pLC5-ciR-NC）和 circPRKD3 過表達載體（pLC5-circPRKD3）兩組 PDLSCs 施加 24 小時機械力刺激。結果顯示，circPRKD3 過表達后，RUNX2 在轉錄和翻譯水平的表達均增強（3O、P、R），ALP 僅在 mRNA 水平表達上調（圖 3N、P、Q）。這一結果初步證明了 circPRKD3 在牽張誘導的 PDLSCs 成骨過程中發揮促進作用。

圖3    circPRKD3 的調控對機械刺激下 PDLSCs 成骨的影響。

接下來，為進一步探究 circPRKD3 的功能機制，研究人員研究了 circPRKD3 在細胞核與細胞質中的分布情況。首先通過核質分布研究發現，盡管 circPRKD3 在細胞核和細胞質中均有分布（圖 4A），但在 PDLSCs 的細胞質中占比更高（圖 4B）。基于細胞質中 miRNAs 可與 circRNAs 形成 “海綿” 作用的特性，研究借助四種算法預測出 225 個可能與 circPRKD3 相互作用的 miRNAs，經 miRDB 數據庫進一步篩選至 34 個（圖 4C）。隨后隨機選取 10 個 miRNAs 驗證，最終發現 miR-761、miR-6783-3p、miR-6516-5p、miR-7855-5p 和 miR-214-3p 這 5 個機械敏感 miRNAs 在機械力作用下表達上調（圖 4D），且這一趨勢與 circPRKD3 在牽張誘導下的上調趨勢一致。

為了明確受 circPRKD3 調控的 miRNAs，研究人員發現 circPRKD3 過表達會使 miR-6783-3p 和 miR-7855-5p 表達下降（圖 4E），但 circPRKD3 敲低對二者無顯著影響（圖 4F）。其中 miR-6783-3p 在轉錄水平變化zui明顯，通過數據庫預測到它與 circPRKD3 存在潛在結合位點（圖 4G）。進一步的熒光素酶報告基因實驗證實，miR-6783-3p 模擬物可降低野生型 circPRKD3 報告基因的熒光素酶活性，而對突變型無影響（圖 4H），由此確定 circPRKD3 與 miR-6783-3p 能夠相互結合。

圖4    circPRKD3 下游靶點的篩選與驗證 免疫熒光染色。

然后，為了探究 miR-6783-3p 與 circPRKD3 的相互作用對機械刺激下 PDLSCs 成骨的影響，研究人員首先合成 miR-6783-3p 模擬物并確認其能增強該 miRNA 的調控功能（圖 5A）。對轉染該模擬物的 PDLSCs 施加24小時機械刺激后發現，miR-6783-3p 可使 RUNX2 轉錄表達升高（圖 5C），但 ALP 的表達水平變化并不顯著（圖 5B）。不過，RUNX2 與 ALP 在蛋白質水平的表達均顯著增加（圖 5D-F）。這一結果證實，在機械負荷下，miR-6783-3p 和 circPRKD3 一樣，均能對 PDLSCs 的成骨過程起到促進作用。

最后，實驗進一步驗證了 miR-6783-3p 與 circPRKD3 的 “海綿” 關系。共轉染二者的 PDLSCs 成骨蛋白表達水平低于單獨轉染組（圖 5G-I），說明 miR-6783-3p 可吸附 circPRKD3 調控牽張誘導的 PDLSCs 成骨。同時，針對 RUNX2 的檢測顯示，circPRKD3 和 miR-6783-3p 并不直接結合其蛋白序列（圖 5J）。最終證實，circPRKD3 與 miR-6783-3p 通過相互 “海綿” 作用，間接調控機械刺激下 PDLSCs 的成骨過程。綜上，circPRKD3 與 miR-6783-3p 通過相互 “海綿” 作用間接調控機械刺激下 PDLSCs 的成骨過程（圖 5K）。

圖 5 miR-6783-3p 與 circPRKD3 的相互作用調控機械刺激下牙周膜干細胞（PDLSCs）的成骨

總之，該研究明確了 circPRKD3 在機械力介導的 PDLSCs 成骨分化中表達上調，且其通過吸附 miR-6783-3p作為競爭性內源 RNA 來調控成骨過程。同時證實 miR-6783-3p 對骨形成有正向作用。基于這些發現，circPRKD3 作為關鍵成骨調控因子，未來在牙周組織再生和正畸牙齒移動等領域具有應用潛力。

參考文獻：Liu J, Liu R, Wang H, Zhang Z, Wang J, Wei F. CircPRKD3/miR-6783-3p responds to mechanical force to facilitate the osteogenesis of stretched periodontal ligament stem cells. J Orthop Surg Res. 2024 Apr 22;19(1):257. doi: 10.1186/s13018-024-04727-7. PMID: 38649946; PMCID: PMC11036753.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38649946/
Impact Factor: 2.8
ISSN: 1749-799X

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