紊亂血流誘導自噬并損傷自噬流以擾亂線粒體穩態

Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis

Keywords: OSS; PSS; Autophagy ; Autophagic flux; Mitochondrial homeostasis.

自噬是一種進化保守且受嚴格調控的細胞過程，通過降解蛋白質、細胞器等成分維持細胞功能，其調控與 ATG 基因激活相關，ULK-Atg17 復合物、mTOR 等參與其中，ATG8/LC3 家族、ATG5 在自噬體形成中起關鍵作用，p62 積累是自噬流受損的標志。自噬功能失調與心血管疾病等多種病理狀態相關，而氧化應激是自噬的主要誘導因素，ox-LDL 等可誘導自噬并伴隨 mtDNA 損傷，線粒體因缺乏組蛋白保護易受氧化應激影響。

剪切應力對血管內皮細胞有代謝和機械雙重作用，與動脈粥樣硬化的局灶性相關。動脈分叉處血流模式復雜，側壁的振蕩剪切應力（OSS）會誘導氧化應激，通過激活 NADPH 氧化酶和 JNK 導致線粒體超氧化物增加、mtDNA 損傷等；中壁的脈動剪切應力（PSS）則下調炎癥和氧化應激。研究表明，OSS 可誘導自噬但損傷自噬流，促進線粒體功能障礙等；PSS 則情況相反，而剪切應力的空間和時間變化在很大程度上決定了血管氧化應激和促炎狀態的局灶性，不過血流剪切應力與自噬之間的機械轉導機制仍不明確。

基于此，美國加州大學洛杉磯分校戴維・格芬醫學院內科學系的研究團隊通過研究剪切應力的時間和空間變化與血管代謝效應的關系，發現OSS 損傷自噬流，從而干擾線粒體穩態。 研究結果發表在Antioxidants & redox signaling期刊，題為“Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis”。

首先，為了探究剪切應力空間變化與自噬的關系，研究通過計算流體動力學展示了收縮期和舒張期某一瞬時的 兔主動脈壁面剪切應力的空間變化（∂τ/∂x）和時間變化（∂τ/∂t）（圖 1A） ，并對主動脈弓（暴露于 OSS）和降主動脈（暴露于PSS）進行 p62 免疫染色。結果顯示，在暴露于OSS 的主動脈弓的內皮細胞 p62 染色顯著（圖 1B） ，而在暴露于 PSS 的降主動脈中，p62 染色幾乎不存在（圖 1C）。結果表明 剪切應力的空間變化與 p62 染色相關，也為研究剪切應力時間變化（PSS 與 OSS） 是否差異誘導自噬奠定了基礎。

圖1   剪切應力的空間變化差異性增加兔主動脈中 p62 的積累。

接著，為了探究剪切應力時間變化（PSS 與 OSS）對自噬的影響，研究將人主動脈內皮細胞分別暴露于兩種應力中 4 小時。結果顯示，OSS 使 LC3-II/LC3-I 比值顯著升高（較靜態組增 120%，較 PSS 組增 77%），并使 p62 水平增加 37%（圖 2A），同時OSS 顯著促進通過 Earle's 平衡鹽溶液（EBSS）誘導的饑餓性自噬也能增加自噬體形成 （圖2B）；而 PSS 僅輕微提高 LC3 比值（23%），對 p62 水平和自噬體形成無顯著影響（圖 2A與圖 2B）。此外，饑餓誘導的自噬也會增加自噬體標記物（圖 2B）。這些結果表明 OSS 能顯著誘導自噬。

為了進一步明確 OSS 對自噬流的調節，研究人員比較了在自溶酶體抑制劑巴佛洛霉素存在時的 LC3 比值和 p62 水平。結果顯示，EBSS 誘導自噬時 LC3 比值升高、p62 降低，而 EBSS 與巴佛洛霉素聯合處理則使兩者均進一步升高（圖 2C）。OSS 與巴佛洛霉素聯合處理也使 LC3 比值和 p62 水平較單獨 OSS 組升高（圖 2C）。這表明 OSS 雖能通過增加 LC3-II/LC3-I 比值誘導自噬，但會因 p62 水平升高而損傷自噬流，導致自噬過程不完整。

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圖2   剪切應力的時間變化（OSS vs. PSS ）差異性誘導HAECs 的自噬。

已有研究表明 OSS 可通過激活 NADPH 氧化酶和 JNK 信號通路誘導內皮細胞產生超氧化物。研究人員通過轉染 MnSOD 腺病毒減少線粒體超氧化物，結果顯示，MnSOD 過表達顯著降低了 OSS 誘導的 LC3-II/LC3-I 比值（與靜態條件相比，p<0.05，n=4）（圖 3A）。 使用抗氧化劑 NAC、JNK 抑制劑 SP600125 處理人主動脈內皮細胞，均顯著降低了 OSS 誘導的 LC3-II/LC3-I 比值（圖 3B、C）。這表明，OSS 通過介導超氧化物產生和 JNK 磷酸化來誘導自噬。

圖3   OSS 誘導的氧化應激及 JNK 激活可激活自噬。

進一步研究發現，OSS 會顯著增加人主動脈內皮細胞的線粒體超氧化物（mtO₂・⁻）產生（圖 4A）。而 EBSS 可減輕 OSS 對自噬流的抑制并減少 mtO₂・⁻產生（圖 4A）。雷帕霉素處理也有類似效果；反之，用 siRNA 敲低 ATG5 則會增強線粒體超氧化物的熒光強度（圖 4B）。這表明，誘導自噬能夠減輕 OSS 介導的mtO₂・⁻ 產生。

圖4    EBSS 激活的自噬減輕了OSS 誘導的mtO₂・⁻ 產生。

然后研究發現，OSS 會顯著降低線粒體呼吸（降幅 46%），EBSS 誘導的自噬逆轉了 OSS 介導的線粒體呼吸降低（圖 5A）。OSS 會顯著降低線粒體復合體 II 活性（降幅 43%），而 而 EBSS 可恢復該活性（圖 5B）。雷帕霉素誘導的自噬也能恢復 OSS 降低的復合體 II 活性。這表明，自噬的誘導可恢復線粒體呼吸功能。

圖5   EBSS 激活的自噬恢復了OSS 介導的線粒體呼吸降低。

mtDNA 因不與組蛋白結合而易受氧化損傷。研究發現，OSS 可誘導 mtDNA 損傷（表現為 8-OHdG 積累且與線粒體共定位）（圖 6A）。OSS 使 mtDNA 損傷增加 4.5 倍（圖 6B），而對核 DNA 損傷無顯著影響（圖 6C）。進一步實驗顯示，過表達 MnSOD、使用抗氧化劑NAC 或 JNK 抑制劑 SP600125，均能顯著減輕 OSS 誘導的 mtDNA 損傷（圖 7A-7C） 。這表明，OSS 通過誘導 mtO₂・⁻產生和激活 JNK 信號通路來促進 mtDNA 損傷。

圖6   OSS 誘導線粒體 DNA損傷。

圖7   抗氧化劑和 JNK 抑制劑可逆轉OSS 誘導的線粒體 DNA損傷。

最后，為了在體內研究 OSS 誘導的 JNK 激活和 mtDNA 損傷的空間變化，研究對新西蘭白兔的主動脈弓和降主動脈進行免疫染色，發現主動脈弓中氧化 DNA 損傷標志物 8-OHdG 和磷酸化 JNK 的染色顯著，而降主動脈中幾乎無染色（圖 8）。這表明剪切應力的空間變化（如主動脈弓的不同彎曲部位與降主動脈之間）和時間變化（OSS 與 PSS）會差異性地誘導自噬和自噬流（圖 1），從而調節線粒體穩態（圖 6）。

圖8   剪切應力的空間變化差異性地促進新西蘭白兔的 DNA 損傷和 JNK 激活。

圖9   OSS 調控自噬的機制示意圖。

總之，血流剪切應力的空間和時間變化會調節內皮細胞代謝狀態，與動脈粥樣硬化病變的局灶性和偏心性相關。雖流體剪切應力與氧化應激的機械轉導機制已明確，但研究進一步揭示了紊亂血流的新代謝作用：一是通過影響 LC3-II/LC3-I 比值促進自噬體生成，二是通過 p62 積累損傷自噬流。同時，還闡明了 OSS 介導的氧化應激和 JNK 信號通路在激活自噬、調節線粒體穩態中的作用（圖 9）。

參考文獻：Li R, Jen N, Wu L, Lee J, Fang K, Quigley K, Lee K, Wang S, Zhou B, Vergnes L, Chen YR, Li Z, Reue K, Ann DK, Hsiai TK. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxid Redox Signal. 2015 Nov 20;23(15):1207-19. doi: 10.1089/ars.2014.5896. Epub 2015 Jun 29. PMID: 26120766; PMCID: PMC4657520.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26120766/
Impact Factor: 6.1
ISSN: 1523-0864 (Print); 1557-7716 (Electronic) 

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