復(fù)合模式層析在雙抗純化中的多重策略
雙特異性抗體（BsAbs）以其多靶點(diǎn)機(jī)制在腫瘤免疫治療中展現(xiàn)巨大潛力。截至2024年底，已有19款BsAb藥物上市，300多項(xiàng)臨床試驗(yàn)在全球范圍內(nèi)開展。
由于雙特異性抗體的巨大治療潛力促使迄今為止已開發(fā)出超過50種不同的重組雙特異性抗體結(jié)構(gòu)。其可大致分為兩類：不含F(xiàn)c區(qū)的（Non IgG like BsAb）和含F(xiàn)c區(qū)域（IgG like BsAb），含F(xiàn)c區(qū)域又分為對稱性(Symmetric)和非對稱性雙抗（Asymmetric）。
但BsAbs獨(dú)特的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，也帶來了大量產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，如同源二聚體（homodimer）、輕鏈缺失產(chǎn)物（LC-missing byproduct）、半抗（half antibody）以及聚集體等。由于這些雜質(zhì)與目標(biāo)分子的物理化學(xué)性質(zhì)接近，常規(guī)的離子交換層析往往難以實(shí)現(xiàn)有效分離。
為此，復(fù)合模式層析（Mixed-Mode Chromatography）作為一種集多種作用力于一體的新型分離純化介質(zhì)，正在雙抗純化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
博格隆研發(fā)的Diamond MMC Mustang為代表的復(fù)合模式介質(zhì)，具有以下多重機(jī)制：
•弱陽離子交換作用
•氫鍵作用
•疏水作用
可廣泛適用于聚集體、片段、輕鏈缺失產(chǎn)物、半抗、同源二聚體等復(fù)雜雜質(zhì)的去除。
•分子：Bispecific antibody
•樣品：Protein A eluate (pH adjusted to 5.5)
•Buffer：50 mM NaAc-HAc, pH 5.5；50 mM NaAc-HAc, 1 M NaCl, pH 5.5
•上樣載量：35 g/L 與 80 g/L
•梯度：0-100% B 20CV線性鹽濃度遞增
結(jié)果：Diamond MMC Mustang在不同載量下分辨率穩(wěn)定，媲美進(jìn)口對標(biāo)產(chǎn)品
Fig.1 Diamond MMC Mustang與某進(jìn)口介質(zhì)分離純化層析圖譜
Fig.2 Diamond MMC Mustang與某進(jìn)口介質(zhì)分離后樣品的SDS-PAGE結(jié)果
去除輕鏈缺失產(chǎn)物•分子：Symmetric WuXiBody
•分離原理：pI差異（雙抗與LC-missing byproduct相差0.21）→結(jié)合力不同 → 成功分離
•樣品：Protein A eluate (pH adjusted to 6.0)
•Buffer：40 mM phosphate buffer, pH 6.0；40 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 6.0
•梯度：0-100% B 20CV線性鹽濃度遞增
結(jié)果：實(shí)現(xiàn)雙抗與LC-missing byproduct的分離，由SDS-PAGE圖可峰尾為LC-missing byproduct。
Fig.3 復(fù)合陽離子介質(zhì)分離LC-missing byproduct層析圖譜以及質(zhì)控
線性pH梯度去除半抗與homodimer•分子：Bispecific antibody(Asymmetric IgG-like knobs-into-holes)
•分離原理：半抗、hole-hole homodimer、bsAb、聚集體在復(fù)合性陽離子上的結(jié)合力差異
•樣品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)
•Buffer：20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mMTris, 20mM glycine, pH 5.5；20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mM Tris, 20mM glycine, pH10.0
•梯度：0-100% B 20CV線性pH遞增
結(jié)果：由層析圖譜和SDS-PAGE圖可知成功分離半抗、homodimer與聚集體
Fig.4 復(fù)合陽離子介質(zhì)分離半抗、homodimer層析圖譜以及質(zhì)控
利用疏水作用去除片段與聚集體•分子：Bispecific antibody
•分離原理：高鹽結(jié)合，低鹽洗脫 → 去除片段與聚集體
•樣品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)
•Buffer：50 mM Tris-HAc, 1 M (NH4)2SO4, pH 7.0；50 mM Tris-HAc, pH 7.0
•上樣載量：30 g/L
•梯度：0-100% B 20CV 鹽濃度遞減（1M (NH₄)₂SO₄ → 0）
結(jié)果：成功分離片段與聚集體，與進(jìn)口對標(biāo)產(chǎn)品表現(xiàn)一致
Fig.5 復(fù)合陽離子介質(zhì)分離片段、聚集體層析圖譜以及質(zhì)控
為了評估填料的批次間的一致性，本實(shí)驗(yàn)使用三個(gè)不同批次的Diamond MMC Mustang介質(zhì)分別裝填的色譜柱，在相同條件下進(jìn)行了三次純化。
•由疊加層析圖譜，可知三批次洗脫圖譜重現(xiàn)性高，分離效果優(yōu)異，,三個(gè)批次性能高度一致，如下圖所示
•三批次5%DBC也表現(xiàn)出一致性（批次1、2和3的5%DBC分別為94、94和95 mg/ml）
•三批次洗脫液質(zhì)量、收率表現(xiàn)一致
Fig.6 Diamond MMC Mustang介質(zhì)三個(gè)批次的層析圖譜
復(fù)合模式層析作為雙抗下游純化的重要補(bǔ)充手段，憑借其多種作用機(jī)制，能有效解決常規(guī)層析難以分離的雜質(zhì)問題。它不僅為產(chǎn)品質(zhì)量提升提供保障，也為工藝流程簡化提供了新思路。
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參考文獻(xiàn)
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