游離藥物濃度檢測——生物樣本分析前處理技術(shù)

關(guān)鍵詞：游離藥物濃度，F(xiàn)ree Concentration，生物樣本前處理，生物樣品前處理，平衡透析法，equilibrium dialysis（ED），超濾法，Ultra-filtration（UF），快速平衡透析裝置，RED，血漿蛋白結(jié)合，Plasma Protein Binding(PPB)

游離藥物濃度（Free Concentration）是指生物樣本（如血漿、血清、組織液等）中未與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)合的游離態(tài)藥物、激素、代謝物或其他小分子分析物的濃度。由于許多生物活性物質(zhì)在體內(nèi)會與蛋白質(zhì)（如白蛋白、α₁-酸性糖蛋白、免疫球蛋白等）結(jié)合，只有游離部分才能發(fā)揮藥理或生理活性，因此測定游離藥物濃度（Free Concentration）在藥代動力學(xué)（PK）、藥效學(xué)（PD）、臨床監(jiān)測和生物分析樣本前處理過程中具有重要意義。

一、游離濃度的前處理技術(shù)
在生物樣本（如血液、尿液、組織等）中測定游離（未結(jié)合）藥物、激素或其他分析物的濃度時，生物樣本前處理步驟需確保目標(biāo)物質(zhì)的游離狀態(tài)不被破壞，同時去除干擾物質(zhì)。目前的游離藥物濃度分析生物樣品前處理技術(shù)有平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）、超速離心法（Ultracentrifugation，UC）、凝膠過濾/尺寸排阻色譜（Size-Exclusion Chromatography, SEC）、固相萃取或免疫親和純化和化學(xué)或酶解處理（結(jié)合型釋放后檢測），但常用的是平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation，UC），其中平衡透析法更是游離藥物濃度生物樣品前處理技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。

1.1 平衡透析法
平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）是測定生物樣本（如血漿、血清）中游離藥物、激素或代謝物濃度的金標(biāo)準(zhǔn)方法，常用于血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)（Plasma Protein Binding, PPB），其核心原理是利用半透膜使游離小分子在樣本與緩沖液之間達(dá)到平衡，而大分子結(jié)合物（如蛋白結(jié)合型藥物）因無法透過膜被分離。

【試驗(yàn)步驟】
1、樣本準(zhǔn)備：血漿、血清、腦脊液或其它基質(zhì)
2、透析裝置：不銹鋼特氟龍板平衡透析裝置（HTD）或快速平衡透析裝置（RED）
3、膜選擇：纖維素膜
4、加樣：供體室加入含藥基質(zhì)，受體室加入PBS
5、孵育：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~24小時，根據(jù)裝置決定孵育時間
6、終止與收集：分別從供體室和受體室取一定體積的溶液，用LC-MS/MS、HPLC或免疫分析法檢測濃度。

由上可知，平衡透析法的關(guān)鍵步驟在于裝置、膜的選擇、平衡時間的優(yōu)化等三個方面。IPHASE作為體外研究生物試劑的引領(lǐng)者，為提供更好的服務(wù)，開發(fā)了普通平衡透析裝置（HTD）和快速平衡透析裝置（RED）兩種，均配以纖維素膜，以期滿足不同客戶的多種需求。它們在原理上相似，但在實(shí)驗(yàn)設(shè)計、操作效率、適用性等方面存在差異，以下為兩者詳細(xì)對比：

參數(shù)	平衡透析（HTD）	快速平衡透析（RED）
平衡時間	12~16小時	4-6小時
最低樣本量	100~200 uL	50~100 uL
準(zhǔn)確性	金標(biāo)準(zhǔn)	金標(biāo)準(zhǔn)
適用結(jié)合率范圍	低至高（游離濃度0.1%~99%）	中至高（游離濃度＞0.5%更可靠）
操作便捷性	需手動組裝，步驟較多	商業(yè)化試劑盒，操作簡便
高通量支持	是（96孔板）	是（48孔板）

 
1.2 超濾法
超濾法（Ultrafiltration, UF）的核心原理是通過離心力驅(qū)動小分子游離分析物通過超濾膜，而大分子蛋白及結(jié)合物被截留。以下是超濾法的全面解析，包括原理、步驟、優(yōu)缺點(diǎn)、優(yōu)化策略及與平衡透析的對比。

【試驗(yàn)步驟】
1、樣本類型：血漿或血清
2、樣本預(yù)處理：3000×g, 10分鐘，去除細(xì)胞碎片或纖維蛋白
3、加樣：將100-200 μL血漿加入超濾離心管
4、離心：37℃ 2000-3000×g, 30分鐘（需優(yōu)化轉(zhuǎn)速和時間，避免膜堵塞或結(jié)合物解離）
5、收集濾液：取濾液（通常10-50 μL）用于檢測（LC-MS/MS、HPLC等）

作為快速經(jīng)濟(jì)測定游離濃度的方法之一，超濾法具有快速高效、使用樣本量少、及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，但同樣由于其裝置的影響，超濾法存在著膜吸附、剪切力干擾及高結(jié)合藥物靈敏度受限等不可忽視的缺點(diǎn)。因此，客戶可根據(jù)自己的試驗(yàn)需求選擇前處理技術(shù)，若需快速篩查或樣本量有限，可優(yōu)先選擇超濾法；若需高精度數(shù)據(jù)，則應(yīng)選擇平衡透析法。
1.3 超速離心法
超速離心法(Ultracentrifugation, UC)是一種基于物理分離的技術(shù)，通過極高的離心力（通常 >100,000×g）將生物樣本中的游離分析物與結(jié)合型分析物（如蛋白結(jié)合物）分離。該方法適用于血漿、血清、腦脊液等樣本中游離藥物、激素或代謝物的測定。其原理是依據(jù)在超高速離心條件下，由于分子大小和密度的差異，大分子（如蛋白質(zhì)、蛋白結(jié)合型分析物）因分子量大、密度高而沉降到管底，而游離的小分子（未結(jié)合）則保留在上清液中。

【試驗(yàn)步驟】
1、樣本類型：血清、血漿、組織樣本
2、離心速度：100,000–150,000×g，速度過低可能導(dǎo)致結(jié)合物沉降不完全
3、離心時間：30min-2小時，時間過長可能導(dǎo)致游離分子吸附或降解
4、溫度：4℃（推薦）或室溫，低溫減少蛋白變性和結(jié)合物解離
5、離心管類型：聚碳酸酯或超離心專用管，避免使用易吸附分析物的材質(zhì)
6、收集濾液：小心吸取上清液（避免擾動沉淀），用于后續(xù)分析（如HPLC、LC-MS/MS）；
若需測定結(jié)合型分析物，可溶解沉淀（如用緩沖液或有機(jī)溶劑）后檢測。

超速離心法(Ultracentrifugation, UC)由于其不引入抗體、吸附劑等物質(zhì)，具有無外源干擾、適用性強(qiáng)和樣本兼容性強(qiáng)等3種優(yōu)點(diǎn)，但由于其通過高速離心進(jìn)行分離，亦存在潛在結(jié)合物解離、樣本損傷多及硬件設(shè)施不滿足試驗(yàn)等問題。因此，若實(shí)驗(yàn)條件允許，可結(jié)合超濾或平衡透析進(jìn)行方法驗(yàn)證，確保數(shù)據(jù)可靠性。



綜上所述，常見的游離濃度樣本分析前處理技術(shù)包括平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation，UC），它們有各自的適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。因此，客戶應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況以選擇合適的方法進(jìn)行游離濃度的獲取。

參數(shù)	平衡透析（ED）	超濾（UF）	超速離心（UC）
分離原理	擴(kuò)散平衡	膜截留+離心力驅(qū)動	沉降速度差異
速度	慢（小時級）	快（分鐘級）	中等（1-2小時）
是否干擾平衡	幾乎不干擾	可能干擾（濃差極化）	可能干擾（高壓/剪切力）
樣品量	微量（50-200 uL）	中小量（100-500 uL）	中大量（0.5-2 mL）
適用場景	科研（結(jié)合常數(shù)測定）	臨床（快速檢測）	特殊體系（脂蛋白、納米顆粒）
成本	低（透析膜成本低）	中（超濾管一次性）	高（設(shè)備昂貴）

綜上所述，游離濃度的生物樣本分析前處理主要有平衡透析法、超濾法和超速離心法等三種方法，作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，IPHASE可以給平衡透析前處理提供血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置、一次性快速平衡透析板、可重復(fù)使用快速平衡透析板、快速平衡透析插件、平衡透析膜、血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置封口膜、血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置底座、特氟龍板和超濾管等多類產(chǎn)品。

名稱	規(guī)格
血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置	24/48/96孔
一次性快速平衡透析板	1 Plate,48 Wells
可重復(fù)使用快速平衡透析板	1 Plate,48 Wells
快速平衡透析插件10個,12-14kDa	10 Inserts,12-14kDa
快速平衡透析插件10個,8kDa	10 Inserts,8kDa
快速平衡透析插件50個,12-14kDa	50 Inserts,12-14kDa
快速平衡透析插件50個,8kDa	50 Inserts,8kDa
快速平衡透析裝置48插管	48 Inserts,12-14kDa
快速平衡透析裝置48插管	48 Inserts,8kDa
平衡透析膜	3.5kd，12-14kd，25kd，50kd
血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置封口膜	100 Sheets
特氟龍板	96孔-9塊，24孔-5塊，48孔-7塊
超濾管	0.5mL 10 kd/50支
血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置底座	1個

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