腦立體定位注射技術在研究線粒體移植治療小腦神經退行性疾病中的應用
在神經科學領域，小腦神經退行性疾病一直是困擾醫學界的難題。這些疾病常以小腦性共濟失調為主要表現，目前尚無完全糾正潛在神經退行性病變過程的有效療法。近期第四軍醫大學王亞云教授團隊在 Nature Communications 發表題為“Mitochondria transplantation transiently rescues cerebellar neurodegeneration improving mitochondrial function and reducing mitophagy in mice”的重要研究成果，為這類疾病的治療帶來了新的曙光。
神經退行性疾病的特征是神經元功能進行性受損和喪失，小腦神經退行性疾病（CBND）則表現為小腦性共濟失調，像共濟失調毛細血管擴張癥、脊髓小腦共濟失調等都屬于此類。線粒體功能障礙在神經退行性疾病中扮演著關鍵角色，尤其是浦肯野細胞（PCs）中的線粒體損傷，被認為是CBND的核心發病機制之一。因此，針對PCs中線粒體的干預措施，有望成為治療CBND的有效策略。線粒體移植技術已應用于兒科心肌缺血患者，并在動物模型和細胞系研究中顯示出對神經系統疾病的治療潛力，但它在治療CBND方面的效果和機制仍有待探索。
構建小鼠模型，模擬疾病進程
研究人員構建了兩種小鼠模型：一種是條件性敲除Drp1基因的小鼠（PCKO小鼠），該基因的敲除會導致PCs發生廣泛且進行性的凋亡，進而引發小腦萎縮、共濟失調等癥狀；另一種是表達TdTomato蛋白的CBND小鼠（CBNDTdTomato小鼠），用于確保實驗穩定性并排除免疫熒光染色的干擾。通過對這些小鼠的觀察和檢測，研究人員發現PCKO小鼠在3個月大時，小腦萎縮明顯，PCs數量顯著減少，同時伴有運動功能障礙和神經膠質細胞激活。CBNDTdTomato小鼠也呈現出類似的PCs退化和小腦萎縮現象，且運動功能在1個月大時就出現異常。
鑒于PCKO小鼠的線粒體缺陷以及線粒體移植在其他神經疾病中的治療潛力，研究人員將野生型小鼠肝臟來源的線粒體用腦立體定位注射系統注射到PCKO小鼠的小腦中。在移植前，研究人員對分離的線粒體進行了嚴格的質量控制，確保其生物活性、純度和完整性。
研究發現，移植線粒體的1月齡CBNDgeneral小鼠和CBNDTdTomato小鼠在運動功能上有顯著改善，表現為平衡木測試中通過時間縮短、后足滑倒次數減少，同時PCs數量增加，小腦萎縮得到緩解。不過，這種治療效果在成年CBNDgeneral小鼠中并不明顯，這提示足夠數量的PCs對于線粒體移植發揮治療作用至關重要。
深入探究作用機制
研究人員進一步深入探究線粒體移植后的作用機制。他們發現，移植的線粒體能夠進入PCs，并在其中持續存在至少4周，且能與內源性線粒體相互作用。同時，線粒體移植顯著改善了PCs的線粒體形態和功能，增加了ATP水平，增強了線粒體膜電位，減少了ROS生成，還緩解了Caspase3介導的細胞凋亡和Parkin依賴的線粒體自噬。此外，研究還發現，缺乏DRP1或呼吸能力的線粒體無法改善CBNDgeneral小鼠的行為異常，這表明移植線粒體的功能完整性是發揮治療效果的關鍵。
本研究構建了多種基因編輯小鼠模型，實現對疾病精準模擬。在實驗過程中，對移植線粒體質量進行嚴格把控。在分離線粒體時，采用特定試劑盒及規范流程，確保線粒體純度。通過Mitotracker染色等多種方法評估線粒體生物活性和完整性，確保其質量上乘。使用腦立體定位注射技術（瑞沃德腦立體定位注射系統）將健康的肝臟來源線粒體精準地注射到實驗小鼠的小腦中，整個線粒體移植過程嚴格控制在1小時內，且對移植后不同時間點的線粒體進行追蹤檢測，確保實驗數據可靠，為研究結論提供堅實支撐。
本研究綜合運用多種技術，從分子、細胞和整體水平全面解析線粒體移植機制與效果。免疫熒光染色和RNAscope原位雜交，可在細胞層面精準定位和定量分析蛋白與基因表達，直觀呈現相關分子變化。線粒體相關檢測技術，包括線粒體分離、膜電位檢測、ROS水平測定等，從生化角度深入剖析線粒體功能，為揭示線粒體移植對PCs的影響提供關鍵數據。行為學測試如轉棒測試、平衡木測試，能在整體動物水平評估運動功能，反映疾病發展及治療干預效果。
截止目前，瑞沃德產品及服務覆蓋海內外 100 多個國家和地區，已助力全球1000+科研院所，2500+醫院，6000+高等院校，15000+寵物醫療機構，18000+生物醫藥類企業，助力發表SCI文章14500+篇，贏得了40000+客戶的信賴和支持。
神經退行性疾病的特征是神經元功能進行性受損和喪失，小腦神經退行性疾病（CBND）則表現為小腦性共濟失調，像共濟失調毛細血管擴張癥、脊髓小腦共濟失調等都屬于此類。線粒體功能障礙在神經退行性疾病中扮演著關鍵角色，尤其是浦肯野細胞（PCs）中的線粒體損傷，被認為是CBND的核心發病機制之一。因此，針對PCs中線粒體的干預措施，有望成為治療CBND的有效策略。線粒體移植技術已應用于兒科心肌缺血患者，并在動物模型和細胞系研究中顯示出對神經系統疾病的治療潛力，但它在治療CBND方面的效果和機制仍有待探索。
構建小鼠模型，模擬疾病進程
圖1. 小腦神經變性模型（CBND）構建
線粒體移植改善小腦神經變性
為探究補充Drp1能否改善共濟失調癥狀，研究人員在1月齡CBNDgeneral小鼠的小腦中注射Drp1-DIO-OE病毒，使Drp1基因過表達。然而，行為學測試結果顯示，Drp1過表達并未改善小鼠的協調能力和平衡能力，這表明單純上調Drp1無法有效緩解PCs的退化和運動功能障礙。鑒于PCKO小鼠的線粒體缺陷以及線粒體移植在其他神經疾病中的治療潛力，研究人員將野生型小鼠肝臟來源的線粒體用腦立體定位注射系統注射到PCKO小鼠的小腦中。在移植前，研究人員對分離的線粒體進行了嚴格的質量控制，確保其生物活性、純度和完整性。
圖2. CBND小鼠小腦線粒體移植（作者使用瑞沃德公司腦立體定位注射系統進行線粒體移植）
研究發現，移植線粒體的1月齡CBNDgeneral小鼠和CBNDTdTomato小鼠在運動功能上有顯著改善，表現為平衡木測試中通過時間縮短、后足滑倒次數減少，同時PCs數量增加，小腦萎縮得到緩解。不過，這種治療效果在成年CBNDgeneral小鼠中并不明顯，這提示足夠數量的PCs對于線粒體移植發揮治療作用至關重要。
圖3. 線粒體移植后早期效果評估
深入探究作用機制
圖4. 外源性線粒體示蹤
圖5. 線粒體移植改善 CBND 小鼠功能的機制探究
研究方法亮點
這項研究首次證實了在線粒體移植減少了神經退行性病變小腦內PCs的凋亡和線粒體自噬，從而延緩小腦神經退行性變，為小腦神經退行性疾病的治療提供了新的方向。本研究構建了多種基因編輯小鼠模型，實現對疾病精準模擬。在實驗過程中，對移植線粒體質量進行嚴格把控。在分離線粒體時，采用特定試劑盒及規范流程，確保線粒體純度。通過Mitotracker染色等多種方法評估線粒體生物活性和完整性，確保其質量上乘。使用腦立體定位注射技術（瑞沃德腦立體定位注射系統）將健康的肝臟來源線粒體精準地注射到實驗小鼠的小腦中，整個線粒體移植過程嚴格控制在1小時內，且對移植后不同時間點的線粒體進行追蹤檢測，確保實驗數據可靠，為研究結論提供堅實支撐。
本研究綜合運用多種技術，從分子、細胞和整體水平全面解析線粒體移植機制與效果。免疫熒光染色和RNAscope原位雜交，可在細胞層面精準定位和定量分析蛋白與基因表達，直觀呈現相關分子變化。線粒體相關檢測技術，包括線粒體分離、膜電位檢測、ROS水平測定等，從生化角度深入剖析線粒體功能，為揭示線粒體移植對PCs的影響提供關鍵數據。行為學測試如轉棒測試、平衡木測試，能在整體動物水平評估運動功能，反映疾病發展及治療干預效果。
截止目前，瑞沃德產品及服務覆蓋海內外 100 多個國家和地區，已助力全球1000+科研院所，2500+醫院，6000+高等院校，15000+寵物醫療機構，18000+生物醫藥類企業，助力發表SCI文章14500+篇，贏得了40000+客戶的信賴和支持。
瑞沃德定位儀家族
文獻原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-58189-4
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