慢病毒載體下游純化工藝的突破與挑戰

嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法在腫瘤治療領域取得了突破性進展，而慢病毒載體（Lentiviral Vector, LV）作為基因遞送系統的核心原材料，其下游純化工藝的優化直接關系到治療的安全性和經濟性。本文系統綜述了LV下游純化工藝的三大階段——澄清過濾、純化與精純滅菌的技術進展，重點探討切向流過濾（TFF）的應用策略，分析膜材料選擇、工藝參數控制對LV活性與回收率的影響，并提出規模化生產中面臨的挑戰與未來研究方向。
 
CAR-T療法與慢病毒載體的重要性
CAR-T療法通過基因工程改造患者T細胞實現精準抗腫瘤效應，其臨床療效已在血液系統惡性腫瘤中取得顯著突破。然而，CAR-T細胞生產工藝復雜，其中慢病毒載體介導的基因轉導環節成本占比高達30%-50%，且LV的活性與純度直接影響CAR-T細胞的功能與安全性。因此，構建高效、穩定且符合GMP要求的LV下游純化工藝，成為推動CAR-T療法產業化的核心課題。

 

慢病毒載體下游純化的三大步驟
慢病毒的活性受到工藝過程中溫度、pH、鹽濃度、滲透壓以及剪切力的影響，因此在下游純化過程中需要格外關注這些條件對慢病毒載體活性的影響。

澄清過濾旨在去除細胞培養液中的細胞碎片及大顆粒雜質（>1 μm）。當前主流的工藝結合低速離心（<5000×g）與深層過濾技術，通過錯流設計可有效降低濾器堵塞風險，尤其適用于中試及以上規模的連續處理。例如，采用孔徑為0.45-1.2 μm的聚醚砜（PES）深層濾膜，可高效截留顆粒污染物并減少80%以上的宿主細胞蛋白（HCP）負載量，為后續純化階段奠定高質量基礎。

適用于LV中度純化的策略主要包括層析和切向流過濾。切向流過濾（TFF）中的超濾滲濾（UFDF）是慢病毒載體（LV）大規模純化和濃縮以及緩沖液置換的關鍵步驟。
在UFDF過程中，病毒顆粒被濃縮的同時，分子量小于膜孔徑的雜質（如DNA）會隨透過液被有效去除。從工藝流程的角度來看，TFF既可以在澄清后階段應用，通過濃縮減少后續層析步驟的料液體積，也可以在中度純化和精純之間使用，通過緩沖液置換調節樣品的pH和電導率，從而為后續層析操作創造有利條件。
由于LV容易失活，工藝過程中需要嚴格控制剪切力、通量、跨膜壓和操作時間等參數，并選擇合適的膜材料和孔徑，以確保LV的活性。適用于LV純化的膜材料包括聚醚砜（PES）和再生纖維素（RC）。此外，膜孔徑的選擇也至關重要：孔徑越大，雜質清除率越高，但可能導致LV回收率下降。因此，需要根據具體工藝條件選擇最合適的膜材料和孔徑。

適用于LV精純的策略主要有SEC（尺寸排阻色譜）以及TFF（切向流過濾）。通過TFF進一步濃縮，供需要更高濃度病毒的群體使用。不過高剪切力（>5000 s⁻¹）與跨膜壓（TMP>1.5 bar）易導致LV衣殼破裂，需通過動態壓力控制將通量維持在20-40 LMH以維持活性。最后進行無菌過濾，通常選用0.22μm的濾膜進行過濾進行灌裝。

▲Oxford BioMedica為諾華Kymriah代工的慢病毒制造流程（圖片來源：Molecular Therapy）

當前挑戰和未來方向
盡管LV純化技術已取得顯著進展，仍存在以下瓶頸：

為進一步提升LV生產的可及性與經濟性，未來研究可聚焦于：

慢病毒載體（LV）下游純化是CAR-T療法產業化的核心環節，而切向流過濾（TFF）的應用顯著提升了LV的純度和回收率。然而，膜污染、工藝穩定性及冷鏈依賴仍是主要挑戰。未來，通過新材料開發、連續流工藝優化和凍干技術創新，有望進一步突破技術瓶頸，推動CAR-T療法從實驗室走向更廣泛的臨床應用。