PCR反應原理及PCR儀溫度梯度功能的作用

PCR（聚合酶鏈式反應）‌是一種在體外擴增特定DNA片段的技術。其基本原理是模擬DNA的自然復制過程，在體外利用DNA聚合酶實現(xiàn)DNA的快速擴增。
 
PCR反應體系包括：

• ‌模板‌：待擴增的核酸片段。
• ‌引物‌：人工合成的寡核苷酸，用于啟動DNA合成。
• ‌dNTPs‌：四種脫氧單核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。
• ‌DNA聚合酶‌：如Taq酶，在高溫下保持活性，催化反應的完成。
• ‌Mg²⁺：穩(wěn)定DNA聚合酶的活性。

PCR反應原理
 
PCR的基本原理是基于DNA的變性、退火和延伸三個步驟的循環(huán)過程：

3‌、延伸‌：在適宜的溫度下（72℃左右），DNA聚合酶以引物為起點，合成新的DNA鏈。

這三個步驟構成一個循環(huán)，每完成一個循環(huán)，DNA的數(shù)量就會翻倍。經(jīng)過多次循環(huán)，可以獲得大量的目標DNA片段‌。
 

 
建立一個成熟穩(wěn)定的PCR反應所需要的條件：
完整且純凈的模板（膠圖和nanodrop測值評價）
高特異高品質(zhì)的引物（引物設計軟件評分）
組分搭配適宜的反應體系（比如針對模板的GC比，是否考慮添加DMSO或甜菜堿；高保真或高得率應添加多少鎂離子）
 
合理的擴增反應程序（在引物Tm值附近進行多次實驗摸索最佳退火溫度）

確定合理的擴增反應程序與PCR儀直接相關。如果PCR儀具備溫度梯度功能，則可以通過設置不同的溫度梯度來降低實驗次數(shù)，快速確定退火溫度。

柏恒梯度PCR儀（RePure系列）具備多種溫度梯度功能，助力您的PCR實驗：
 
常規(guī)梯度：單向的首尾兩端設定退火溫度范圍的低值和高值，中間孔位則漸進分布溫度，但首尾之間的孔位不一定呈現(xiàn)等差溫度分布。

線性梯度：單向的中間設定一個溫度，再設定一個相鄰孔位的溫差，設定溫度會按照溫差向兩邊擴散。相鄰孔位的溫度嚴格按照溫差生成，可驗證所感興趣的整數(shù)溫度。縱向生成4個（8孔），橫向生成6個（12孔）。國產(chǎn)品牌只有柏恒具備此功能。
 
線性梯度優(yōu)勢：同時進行多個不同退火溫度的PCR反應，一次實驗就能確定體系最優(yōu)的退火溫度，縮短驗證周期提高實驗效率。

二維梯度：反應模塊的縱向、橫向可以同時設置常規(guī)/線性梯度。使反應模塊形成一個變性/退火均在不同溫度下反應的陣列，通過一次反應摸索出最佳的變性/退火溫度組合。
 
二維梯度優(yōu)勢：
（1） 提高PCR反應的特異性在二維梯度溫度下，引物與模板結合能力的變化，可以使反應具有更高的特異性并減少非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)生。
（2） 提高PCR反應的產(chǎn)物純度通過對反應中各分子靶點進行優(yōu)化，以使放大的DNA產(chǎn)物得到放大。
（3） 檢測基因點突變根據(jù)已知的突變位點設計適當?shù)囊�物，通過PCR擴增得到目標基因的片段，然后對擴增產(chǎn)物進行測序，檢測突變位點。
（4） 檢測種群間的遺傳多樣性通過二維梯度PCR擴增，產(chǎn)物進行測序，發(fā)現(xiàn)突變位點，比對種群間的遺傳物質(zhì)多樣性。
（5） 操作簡單二維梯度PCR僅僅需要配置一個反應體系即可。
（6） 提高陽性檢測準確性二維梯度PCR一次性就可得到96種溫度組合，大大減免了樣品簡單的交叉污染，降低了假陽性出現(xiàn)的幾率，進而提高了真陽性的檢測準確性。
（7） 縮短實驗時間由于二維梯度PCR可以根據(jù)溫度的不同，優(yōu)化出最佳反應溫度，縮短了多次探索變性溫度或者退火溫度的時間。

獨立6溫區(qū)：相鄰溫區(qū)可設置溫差不超過5℃的溫度同時進行退火溫度的摸索，每個溫度分區(qū)下有16孔可作為復孔位。獨立的6個溫度分區(qū)可以按照等差設置溫度也可根據(jù)需要靈活設置每個分區(qū)的溫度。相當于線性梯度的升級版。

同時，柏恒梯度PCR儀均采用前進風后出風的散熱模式，即便多臺PCR儀并排放置或在臺架上密集擺放，也不會因旁邊儀器的散熱風影響控溫的準確性。