PCR反應原理及PCR儀溫度梯度功能的作用

PCR（聚合酶鏈式反應）‌是一種在體外擴增特定DNA片段的技術。其基本原理是模擬DNA的自然復制過程，在體外利用DNA聚合酶實現DNA的快速擴增。
 
PCR反應體系包括：

• ‌模板‌：待擴增的核酸片段。
• ‌引物‌：人工合成的寡核苷酸，用于啟動DNA合成。
• ‌dNTPs‌：四種脫氧單核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。
• ‌DNA聚合酶‌：如Taq酶，在高溫下保持活性，催化反應的完成。
• ‌Mg²⁺：穩定DNA聚合酶的活性。

PCR反應原理
 
PCR的基本原理是基于DNA的變性、退火和延伸三個步驟的循環過程：

3‌、延伸‌：在適宜的溫度下（72℃左右），DNA聚合酶以引物為起點，合成新的DNA鏈。

這三個步驟構成一個循環，每完成一個循環，DNA的數量就會翻倍。經過多次循環，可以獲得大量的目標DNA片段‌。
 

 
建立一個成熟穩定的PCR反應所需要的條件：
完整且純凈的模板（膠圖和nanodrop測值評價）
高特異高品質的引物（引物設計軟件評分）
組分搭配適宜的反應體系（比如針對模板的GC比，是否考慮添加DMSO或甜菜堿；高保真或高得率應添加多少鎂離子）
 
合理的擴增反應程序（在引物Tm值附近進行多次實驗摸索最佳退火溫度）

確定合理的擴增反應程序與PCR儀直接相關。如果PCR儀具備溫度梯度功能，則可以通過設置不同的溫度梯度來降低實驗次數，快速確定退火溫度。

柏恒梯度PCR儀（RePure系列）具備多種溫度梯度功能，助力您的PCR實驗：
 
常規梯度：單向的首尾兩端設定退火溫度范圍的低值和高值，中間孔位則漸進分布溫度，但首尾之間的孔位不一定呈現等差溫度分布。

線性梯度：單向的中間設定一個溫度，再設定一個相鄰孔位的溫差，設定溫度會按照溫差向兩邊擴散。相鄰孔位的溫度嚴格按照溫差生成，可驗證所感興趣的整數溫度。縱向生成4個（8孔），橫向生成6個（12孔）。國產品牌只有柏恒具備此功能。
 
線性梯度優勢：同時進行多個不同退火溫度的PCR反應，一次實驗就能確定體系最優的退火溫度，縮短驗證周期提高實驗效率。

二維梯度：反應模塊的縱向、橫向可以同時設置常規/線性梯度。使反應模塊形成一個變性/退火均在不同溫度下反應的陣列，通過一次反應摸索出最佳的變性/退火溫度組合。
 
二維梯度優勢：
（1） 提高PCR反應的特異性在二維梯度溫度下，引物與模板結合能力的變化，可以使反應具有更高的特異性并減少非特異性雜交產物的產生。
（2） 提高PCR反應的產物純度通過對反應中各分子靶點進行優化，以使放大的DNA產物得到放大。
（3） 檢測基因點突變根據已知的突變位點設計適當的引物，通過PCR擴增得到目標基因的片段，然后對擴增產物進行測序，檢測突變位點。
（4） 檢測種群間的遺傳多樣性通過二維梯度PCR擴增，產物進行測序，發現突變位點，比對種群間的遺傳物質多樣性。
（5） 操作簡單二維梯度PCR僅僅需要配置一個反應體系即可。
（6） 提高陽性檢測準確性二維梯度PCR一次性就可得到96種溫度組合，大大減免了樣品簡單的交叉污染，降低了假陽性出現的幾率，進而提高了真陽性的檢測準確性。
（7） 縮短實驗時間由于二維梯度PCR可以根據溫度的不同，優化出最佳反應溫度，縮短了多次探索變性溫度或者退火溫度的時間。

獨立6溫區：相鄰溫區可設置溫差不超過5℃的溫度同時進行退火溫度的摸索，每個溫度分區下有16孔可作為復孔位。獨立的6個溫度分區可以按照等差設置溫度也可根據需要靈活設置每個分區的溫度。相當于線性梯度的升級版。

同時，柏恒梯度PCR儀均采用前進風后出風的散熱模式，即便多臺PCR儀并排放置或在臺架上密集擺放，也不會因旁邊儀器的散熱風影響控溫的準確性。