多特異性親和-Heparin親和填料應用案例分享
背景介紹
什么是肝素肝素（Heparin）因首先從肝臟發現而得名，天然存在于肥大細胞，現在主要從牛肺或豬小腸提取。肝素是一種黏多糖硫酸脂，由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成。
臨床應用及研究顯示，肝素除具有抗凝作用外，還具有多種生物活性和臨床用途。肝素與多種生物分子都具有親和作用，基于這一特性，博格隆將其共價偶聯到高交聯度瓊脂糖上，制成一種族特異性親和層析介質——Heparin Bestarose FF。
Heparin Bestarose FF具有物理及化學穩定、配基不易脫落、使用壽命長、應用范圍廣泛、容易放大等特點。
肝素親和填料的主要特性
• 高載量：≥2.0mg bovine AT III/mL填裝介質。
• 高選擇性：特異性親和配基，高效純化目標蛋白。
• 高穩定性：耐受常用溶劑，如8M尿素、6M鹽酸胍、0.1M NaOH、4M NaCl等進行清潔。
肝素親和填料的應用領域
藥品與一般親和介質的不同之處在于，肝素與近百種蛋白都具有親和作用，因此Heparin Bestarose FF可廣泛應用于各種生物分子特別是各種酶類的分離純化，包括抗凝血酶III、類凝血酶、人凝血因子IX、XI、VIII、脂蛋白脂肪酶、膠原酶、DNA聚合酶等；也能和人白介素、人前列腺生長因子、重組人血管內皮生長因子、軟骨生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、重組人酸性成纖維細胞生長因子、重組肝細胞生長因子、重組鼠肝素輔因子II、重組人血小板第四因子、重組人內皮抑素、重組人角質細胞生長因子等生物大分子結合。
食品
肝素親和填料除了以上在制藥領域中應用以外，在食品領域也有應用。國家標準GB5009.299—2024《食品安全國家標準 食品中乳鐵蛋白的測定》于2024-02-08發布，并于2024-08-08實施。根據該國標，測定食品中乳鐵蛋白的含量，需使用磷酸鹽緩沖液提取試樣，并且使用肝素親和柱富集凈化后，再進行測定。
Heparin Bestarose FF應用案例
Heparin Bestarose FF能從血漿蛋白中特異性地結合并分離抗凝血酶 Ⅲ，這種蛋白具有極強的抗凝血作用，可用于治療血栓性疾病。
Heparin Bestarose FF能從血漿蛋白中特異性地結合并分離抗凝血酶 Ⅲ，這種蛋白具有極強的抗凝血作用，可用于治療血栓性疾病。
Heparin Bestarose FF從血漿中純化抗凝血酶III
• 層析柱及介質：EzFast 1mL，Heparin Bestarose FF
• 樣品：某動物血漿
• 結合緩沖液：0.1M Tris，0.15M NaCl，pH7.4
• 清洗緩沖液：0.1M Tris，0.33M NaCl，pH7.4
• 洗脫緩沖液：0.1M Tris，2.0M NaCl，pH7.4
Fig. 1 純化后樣品SDS-PAGE圖
使用Tips緩沖液
• 結合緩沖液：20~50mM PB或Tris，pH7.4~8.0，可以加入0.15M NaCl抑制非特異吸附。
• 洗脫緩沖液：20~50mM PB或Tris，1~2M NaCl，pH7.4~8.0。NaCl濃度需要根據目標蛋白的結合力進行適當調整。
流速
根據柱子的高度一般選用60~300cm/h的流速，柱高越大流速越慢。
清洗
定期的清洗能有效防止污染物的累積，保持層析介質穩定的工作狀態。對于不同類型的雜質和污染物建議清洗條件如下：
• 離子鍵結合蛋白的去除：先用3~5個柱體積 2M NaCl清洗，后用3~5個柱體積純水清洗。
• 沉淀或變性蛋白的去除：先用2個柱體積 0.1M NaOH清洗，后用5~10個柱體積純水清洗，也可用6M鹽酸胍或8M尿素清洗。
• 疏水性結合的蛋白的去除：先用0.1%~0.5%的非離子去污劑清洗，后用3~5個柱體積純水清洗。
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