蛋白穩定性分析儀PSA-16助力開發新型高致病性尼帕病毒納米顆粒疫苗
文獻轉載：科學家開發出新型高致病性尼帕病毒納米顆粒疫苗
An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadly neutralizing antibodies and protects against lethal Nipah virus infection
翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司
2024年8月31日，武漢大學病毒學國家重點實驗室趙海艷團隊和中國科學院武漢病毒研究所鄧增欽團隊合作在《npj Vaccines》雜志上發表題為“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadly neutralizing antibodies and protects against lethal Nipah virus infection”的研究論文。本研究以尼帕病毒G蛋白頭部域為抗原靶標，成功開發出一種新型的、安全有效的自組裝蛋白納米顆粒疫苗，該疫苗能夠誘導抑制多種亨尼帕病毒感染的廣譜中和抗體，并對尼帕病毒感染的倉鼠提供完全保護。
Zhou, D. et al.
npj Vaccines 9, 158 (2024).
https://doi.org/10.1038/s41541-024-00954-5
01 前言
尼帕病毒（NiV）是一種負義單鏈RNA病毒，最初是在1998年至1999年馬來西亞和新加坡爆發期間分離和鑒定的。NiV感染可導致嚴重的腦炎和呼吸道疾病，病死率高達75%。另外在幸存者中也觀察到長期神經系統疾病和NiV感染復發。目前，還沒有批準的可用于人類的疫苗或治療方法。NiV編碼一種病毒膜蛋白：糖蛋白（G），G蛋白位于病毒表面，負責受體識別和結合，受體結合后，G蛋白經歷一系列構象變化，完成與靶細胞的膜融合，從而幫助病毒進入靶細胞并引發感染。此外，許多中和和保護性抗體主要針對G蛋白，表明G病毒蛋白是疫苗開發的關鍵抗原。最近已經開發了多種針對NiV感染的疫苗平臺，包括亞基疫苗、mRNAs、病毒樣顆粒（VLP）、病毒載體疫苗和DNA疫苗，但還沒有對自組裝納米粒子平臺進行NiV感染評估。作為納米顆粒疫苗載體，鐵蛋白（Ferritin）可以自組裝成一個八面體籠，周圍排列著24個相同的亞基，并多價顯示抗原。納米粒子的抗原多聚化特性可能允許B細胞受體的多價結合，從而有利于B細胞活化和引發針對遞送抗原的強大免疫反應。由于這些優勢，該遞送系統已被廣泛用于針對不同傳染性病原體和腫瘤的疫苗開發，包括流感疫苗、EB病毒疫苗和新冠肺炎疫苗。為引，來自武漢大學病毒學國家重點實驗室趙海艷團隊和中國科學院武漢病毒研究所鄧增欽團隊于2024年8月合作在《npj Vaccines》上發表題為“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadly neutralizing antibodies and protects against lethal Nipah virus infection”的研究論文。
02 摘要
作者設計了一種基于鐵蛋白的自組裝納米粒子，在表面顯示NiV G頭部結構域（NiV G-鐵蛋白，NiV G-ferritin），并評估了可溶性NiV G頭結構域（NiV sG）或NiV G-鐵蛋白引發的免疫反應，并且通過一系列研究數據表明NiV G鐵蛋白是一種安全有效的尼帕病毒感染候選疫苗。
03 結果
NiV G納米顆粒免疫原的設計和生成先前的研究表明，受體結合位點位于NiV G頭部結構域（Niv G head domain）上，大多數中和抗體和保護性單克隆抗體都以該結構域為靶點。為了在鐵蛋白（ferritin）表面均勻顯示NiV G頭部結構域，將NiV G的C端與鐵蛋白的N端延伸融合，將信號肽融合到NiV G頭部結構域的N端，在Expi293F細胞中進行真核分泌表達。作者通過負染電子顯微鏡（Negative stain EM）檢查了ferritin和NiV G-ferritin的整體結構。Negative stain EM圖顯示，ferritin和NiV G-ferritin都形成了分散的球形顆粒，沒有聚集的跡象，與單獨的ferritin相比，NiV G-ferritin的表面呈尖峰狀。
作者進一步借助北京佰司特科技有限責任公司自主研發的蛋白穩定性分析儀PSA-16，通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理進行NiV G-ferritin和NiV sG的熱穩定性分析，結果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表現出相似的熱穩定性，Tm為~65°C，表明NiV G和ferritin的融合對其結構穩定性沒有顯著影響。
由于NiV G-ferritin可以誘導強大的體液免疫反應，研究者還從NiV G-ferritin免疫小鼠體內篩選、制備了一批單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）。在分離的27種mAbs中，25種mAbs可以有效抑制水皰性口炎病毒（VSV）為骨架的NiV假病毒的感染，其抑制50%的NiV假病毒感染所需要的濃度（IC50）低于10 ng/mL。表位競爭分析發現，篩選得到的27個mAbs可以識別NiV G蛋白上4個不同的抗原表位，包括2個新的此前未被報道的表位。最后，研究者在尼帕病毒感染的致死模型（敘利亞金黃倉鼠）上評估了NiV G-ferritin誘導的免疫反應和保護效果。研究發現給與倉鼠2針或者3針的NiV G-ferritin后，倉鼠體內均產生了高中和活性的血清，且接種2次或者3次均能夠幫助倉鼠100%的抵抗致死劑量NiV的攻擊。研究者進一步檢測了3針疫苗接種倉鼠體內的病毒RNA含量，結果發現，倉鼠的肺臟、腦和脾臟中均未檢測到病毒RNA，表明三劑NiV G-ferritin完全抑制了病毒在倉鼠肺部、大腦和脾臟的復制。
04 方法
克隆、蛋白表達和純化
編碼NiV-M的基因G (NP_112027.1)和F (NP_112026.1) NiV-B的基因(AAY43916.1)和F (AAY43915.1)， G (NP_047112.2)和F (NP_047111.2) of hev,G(YP_009094095.1) of mojv,G(UUV47206.1) of LayV，幽門螺桿菌鐵蛋白(WP_000949190.1)和牛蛙鐵蛋白 ESQVRQQF基因片段(ESQVRQQF)的密碼子經Tsingke優化合成 niv - m、NiVB、 將HeV分別克隆到哺乳動物表達載體中 用于生成假病毒。
負染色電子顯微鏡
純化后的納米顆粒依次稀釋至800/400/200/100/50 nM 然后將10 μL的樣品吸附在300目銅網(北京 大集科易科技有限公司(D11023)靜置1 min，然后，將多余溶液 被濾紙吸走了。網格用2%鈾酰染色 醋酸鹽浸泡30 s，吸去多余的溶液。圖片是 通過透射電子顯微鏡(JEOL, JEM-1400plus)收集 或Talos L120C (Thermo Scientific)電子顯微鏡。
動態光散射(DLS)
蛋白用0.22 μm濾鏡過濾，稀釋至約 0.5mg/mL，使用含有20mMTris-HCl pH 8.0和150mM的緩沖液 生理鹽水。然后，將樣品裝入微比皿中測量 Zetasizer納米ZSP的水動力直徑和多分散性儀器(馬爾文帕analytical)。每個樣品重復三次 在25°C下，每次平行重復持續60 s。水動力的 對樣品的直徑和多分散性指數進行了分析(Malvern Panalytical)。
差示掃描熒光法
使用PSA-16儀器（北京佰司特科技有限責任公司）通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）測定靶蛋白的熱穩定性。將樣品稀釋至0.5mg/mL，并將20μL稀釋后的樣品裝入石英玻璃管中。使用23至97°C的線性溫度掃描，以1°C/min的加熱速度實時動態測量靶蛋白在280nm紫外激發下的330nm和350nm的熒光強度（F）。根據F350nm/F330nm曲線的斜率計算熱變性中點溫度（thermal transition midpoint，Tm）。每個樣品平行測量四次。
多角度光耦合的粒徑排除色譜法散射(SEC-MALS)
每個樣品100 μL體積(NiV g -鐵蛋白0.5mg/mL, 2mg/ mL) mL (NiV sG)注入WTC-030S5色譜柱(Wyatt Technology， Santa Barbara, CA, USA)，等溫運行0.5 mL/min 以20mMTris-HClpH8.0和150mmnacl為移動端 階段。一個MALS檢測器(DAWN®)和一個折射率檢測器(RI) (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA)串聯到 SEC系統上的紫外線探測器。牛血清白蛋白(BSA 采用Scientific)對靜態光散射探測器進行歸一化處理。光 散射，差折射率(dRI)測量，和分子 采用ASTRA軟件(6.1.2.84)(Wyatt Technology)。
酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
采用ELISA法檢測NiV g -鐵蛋白的抗原性。簡單地說,96 - 用3 μg/mL的NiV在4℃下包被ELISA板(康寧)過夜 sG或NiV g -鐵蛋白涂層緩沖液(0.1Mcarbonate, pH9.6)。后四個 用PBS-T(pbs含0.05%Tween 20)沖洗1次后，所有的孔都被堵塞 用50 μL阻斷緩沖液(PBS-T中1% BSA)在37℃下作用2 h。后 阻斷，NiV G單抗HENV-32, HENV-26, nAH1.3，抗狂犬病 病毒單抗RVC20(陰性對照)從5 μg/mL開始依次稀釋 加入板中，37℃孵育2 h PBS-T洗滌4次，然后加入HRP結合的山羊抗人抗體 IgG(1∶20000稀釋，ab克隆，AS002)在37℃下保存1 h。盤子 用50 μL/孔的單組份TMB顯色劑沖洗染色 溶液(NCMBiotech)在37°C下保存10-30分鐘。底物反應 加入50 μL/孔的1M HCl，吸光度為 在450nm處測量(OD450)。對于血清結合滴度檢測，我們 NiV-M、NiV-B、NiV-B的G頭蛋白 將HeV、LayV和MojV包被在ELISA板上，HRP偶聯 采用山羊抗小鼠IgG(1∶8000稀釋，ab克隆，AS003)。
作者也致謝了北京佰司特科技有限責任公司，提供自主研發的蛋白穩定性分析儀PSA-16，獲得蛋白樣品熱穩定性分析的數據。
05 總結
綜上，本研究成功設計了一種以NiV G蛋白頭部域為抗原靶標，以ferritin為展示平臺的新型納米顆粒候選疫苗，并分離了一批具有潛在治療效果的單克隆抗體。研究為深入理解尼帕病毒G蛋白的免疫原性提供了新的見解，NiV G-ferritin有望進一步開發為亨尼帕病毒的廣譜候選疫苗，為全球公共衛生安全提供新的防護策略。
武漢大學病毒學國家重點實驗室趙海艷研究員和中國科學院武漢病毒研究所鄧增欽研究員為該論文的共同通訊作者。武漢大學生命科學學院博士研究生周丹、已畢業的碩士研究生程嬈以及中國科學院武漢病毒研究所高級實驗師姚艷豐博士為論文的共同第一作者。
該研究得到了國家重點研發計劃項目、湖北省衛生健康委青年人才項目和中國科學院院級人才項目的資助，并獲得武漢國家生物安全實驗室和武漢病毒學國家重點實驗室的支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41541-024-00954-5
06 蛋白穩定性分析儀PSA-16
北京佰司特科技有限責任公司于2023年推出了自主研發的第一款國產的蛋白穩定性分析儀PSA-16。
PSA-16的性能和參數達到進口設備的水平，價格卻遠低于進口產品，彌補了目前國產自主設備在蛋白穩定性研究分析領域的空白。
主要參數★ 測定參數：Tm、Cm、ΔG等；
★ 樣品通量：16個；
★ 樣品體積：≤20 uL；
★ 濃度范圍：0.01-200 mg/ml；
★ 溫控范圍：15-110度；
★ 變溫速度：0.1-15度/分鐘；
★ Tm重復性：CV小于1%；
★ 耗材參數：一次性，無需清洗；
★ 八聯排設計，適配多通道移液器；
多功能蛋白穩定性分析儀PSA-16基于內源差示掃描熒光（ifDSF）技術，廣泛應用于蛋白質穩定性研究、蛋白質類大分子藥物（抗體）優化工程、蛋白質類疾病靶點的藥物小分子篩選和結合力測定等領域，具有快速、準確、高通量等諸多優點。蛋白質中色氨酸/酪氨酸的熒光性質與它們所處的環境息息相關，因此可以通過檢測蛋白內部色氨酸/酪氨酸在加熱或者添加變性劑過程中的熒光變化，測定蛋白質的化學和熱穩定性。
PSA-16采用紫外雙波長檢測技術，可精準測定蛋白質去折疊過程中色氨酸和酪氨酸熒光的變化，獲得蛋白的Tm值和Cm值等數據；測定時無需額外添加染料，不受緩沖液條件的限制且測試的蛋白質樣品濃度范圍非常廣（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可廣泛用于去垢劑環境中的膜蛋白和高濃度抗體制劑的穩定性研究。此外，PSA-16具有非常高的數據采集速度，從而可提供超高分辨率的數據。同時PSA-16一次最多可同時測定16個樣品，通量高；每個樣品僅需要15 uL，樣品用量少，非常適合進行高通量篩選。PSA-16操作簡單，使用后無需清洗，幾乎無維護成本。
多功能蛋白穩定性分析儀PSA-16應用涵蓋植物、生物學、動物科學、動物醫學、微生物學、工業發酵、環境科學、農業基礎、蛋白質工程等多學科領域。蛋白質是最終決定功能的生物分子，其參與和影響著整個生命活動過程�，F代分子生物學、環境科學、動醫動科、農業基礎等多種學科研究的很多方向都涉及蛋白質功能研究，以及其下游的各種生物物理、生物化學方法分析，提供穩定的蛋白質樣品是所有蛋白質研究的先決條件。因此多功能蛋白質穩定性分析系統在各學科的研究中都有基礎性意義。
1. 抗體或疫苗制劑、酶制劑的高通量篩選
2. 抗體或疫苗、酶制劑的化學穩定性、長期穩定性評估、等溫穩定性研究等
3. 生物仿制藥相似性研究（Biosimilar Evaluation）
4. 抗體偶聯藥物（ADC）研究
5. 多結構域去折疊特性研究
6. 物理和化學條件強制降解研究
7. 蛋白質變復性研究（復性能力、復性動力學等）
8. 膜蛋白去垢劑篩選，膜蛋白結合配體篩選（Thermal Shift Assay）
9. 基于靶標的高通量小分子藥物篩選（Thermal Shift Assay）
10. 蛋白純化條件快速優化等
北京佰司特科技有限責任公司 (https://www.best-sciences.com)
類器官串聯芯片培養儀-HUMIMIC；灌流式細胞組織類器官代謝分析儀-IMOLA；光片顯微鏡-LSM-200；
蛋白穩定性分析儀-PSA-16；單分子質量光度計-TwoMP；超高速視頻級原子力顯微鏡-HS-AFM；
全自動半導體式細胞計數儀-SOL COUNT；農藥殘留定量檢測儀—BST-100；臺式原子力顯微鏡-ACST-AFM；微納加工點印儀-NLP2000/DPN5000；
