蛋白穩定性分析儀PSA-16助力H9N2流感病毒通用疫苗研究
蛋白穩定性分析儀PSA-16助力H9N2流感病毒通用疫苗研究
蛋白穩定性分析儀PSA-16（北京佰司特科技有限責任公司）助力中國科學院武漢病毒研究所科研人員成功開發出一種針對H9N2流感病毒的表位優化型納米顆粒疫苗，并于2025年6月隊在《ACS Nano》期刊發表了題為“Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H9N2 Influenza Virus”的研究論文。
Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H9N2 Influenza Virus
Mengchan Hao, Yanhai Wang, Wenxue Yang, Meng Xu, Yiwei Guan, Yuan Zhang, JianJun Chen
PMID: 40452158 DOI: 10.1021/acsnano.5c03199
摘要
H9N2禽流感病毒（AIV）對全球家禽業構成日益嚴重的威脅，并持續存在感染人類的風險。疫苗接種是預防和控制H9N2 AIV的關鍵策略。然而，病毒的持續進化不斷挑戰免疫保護的效率。因此，開發一種能夠引發廣譜免疫反應的通用H9N2流感疫苗對于疫情防控至關重要。本研究報道了一種表位優化的納米顆粒（NPs）疫苗，該疫苗能夠引發針對H9N2流感病毒的廣泛交叉反應性免疫。利用計算算法Epigraph，我們首先設計了三個具有優化表位的H9血凝素（HA1）球狀頭部。隨后，每個抗原與mi3 NPs結合，并將這三種構建體以等摩爾比例混合，生成Epigraph疫苗。我們將Epigraph疫苗與目前推薦的候選疫苗病毒（CVV）AL/39進行了比較。Epigraph疫苗在小鼠中有效誘導了交叉反應性抗體，并激活了CD4+和CD8+ T細胞免疫反應。此外，該疫苗對多種H9N2毒株的致死性攻擊提供了有效保護，并顯著降低了小鼠肺部的病毒載量。本研究為應對未來H9N2疫情提供了一種有前景的通用疫苗候選方案。
介紹
H9N2亞型禽流感病毒（AIV）于1966年首次從美國威斯康星州的火雞中分離，現已在歐亞大陸、中東和非洲國家的多種家禽中形成地方性流行，對全球家禽業造成嚴重經濟損失，并在哺乳動物和人類中引發零星感染。自1994年在中國首次分離以來，經過20多年的傳播與進化，H9N2已取代H7N9和H5N6病毒，成為中國禽類中的主要AIV亞型。目前，H9N2無需適應性突變即可直接感染人類，引發不同程度的呼吸道疾病。自1998年首次報告人類感染H9N2病例以來，2014年至2016年間，中國部分省份職業暴露人群的H9N2 AIV血清陽性率已達11.20%，表明禽類從業人員感染H9N2的風險顯著增加。
此外，自2020年以來，人類感染H9N2的病例數量顯著上升。截至目前，已有超過150人感染H9N2 AIV。系統發育分析表明，H9N2病毒是人類H5N1、H7N9、H3N8和H10N8病毒內部基因的供體，凸顯了其在新型流感病毒株出現中的關鍵作用。
近期研究表明，大多數H9N2病毒已獲得與人類型受體（α2,6唾液酸）結合的能力，這凸顯了采取有效措施預防和控制H9N2傳播的緊迫性。開發針對潛在大流行亞型的疫苗是大流行防控的關鍵策略。迄今為止，已開發出多種H9N2候選疫苗。然而，中國的H9N2病毒經歷了廣泛的基因重配，導致新基因型的不斷出現。這種持續的抗原變異顯著促進了病毒在免疫禽類中的傳播。盡管市售H9N2疫苗對匹配抗原的毒株普遍有效，但其對不匹配抗原毒株的保護效力有限。例如，1997年至2002年間分離的大多數H9N2禽流感病毒與代表性疫苗株SD/6/96相比，表現出抗原漂移。疫苗株與流行株之間的不匹配使得有效控制H9N2禽流感病毒的傳播更加復雜，凸顯了改進疫苗技術并產生針對多種H9N2流感病毒的廣泛交叉免疫的迫切需求。
Epigraph是一種高效的基于圖的算法，通過最大化所有潛在9聚體T細胞表位的覆蓋范圍來設計疫苗抗原。該算法已應用于開發治療性HIV疫苗候選物和泛絲狀病毒疫苗候選物。在小鼠和豬模型中，使用Epigraph算法設計的流感病毒候選疫苗表現出優于市售全滅活四價豬流感疫苗的交叉免疫反應。使用Epigraph算法設計的腺病毒載體疫苗已顯示出對豬H3亞型流感病毒的強保護性免疫反應。此外，計算設計的多價Epigraph血凝素疫苗在小鼠模型中表現出對乙型流感病毒的保護效力。該算法能夠高效計算設計單抗原或多抗原疫苗，最大化不同病原體群體的潛在表位覆蓋范圍，并適用于包括疫苗開發在內的抗原設計項目。
血凝素（HA）蛋白是流感病毒表面暴露的糖蛋白，是自然和疫苗介導的甲型流感病毒免疫中最具免疫原性的靶點。HA通過結合細胞表面受體并誘導膜融合啟動感染，同時也是抗流感藥物的主要靶點。位于HA蛋白球狀頭部的受體結合域已被確定為疫苗接種后引發有效中和抗體的關鍵。盡管在開發基于HA的疫苗方面做出了諸多努力，但亞單位疫苗的低免疫原性仍然是一個限制因素。為克服這一限制，已使用多種類型的納米顆粒（NPs）通過多價抗原呈遞增強流感亞單位疫苗的免疫原性，包括病毒樣顆粒（VLPs）、噬菌體、多糖和病毒體。例如，計算設計并優化的突變體i3−01（mi3）已被用作納米級支架以增強抗原免疫原性。
抗原與納米顆粒的偶聯可通過自發連接的SpyTag-SpyCatcher蛋白質共價鍵合策略實現。該系統展現出顯著的連接效率和穩定性。在本研究中，我們將三個表位優化的HA1蛋白通過SpyTag共價連接到經SpyCatcher修飾的納米顆粒上，使目標蛋白能夠輕松附著于納米顆粒表面。通過將三種納米顆粒混合，我們設計了一種Epigraph疫苗候選物。動物實驗表明，該Epigraph疫苗能夠誘導高效且廣泛的體液和細胞免疫反應，并對不同H9N2禽流感病毒株的致死性攻擊提供充分保護。本研究支持Epigraph疫苗作為通用型H9N2流感疫苗的潛在候選物。
結果
H9表位抗原的設計與開發
H9表位抗原是使用Epigraph疫苗在線設計工具https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/EPIGRAPH/epigraph.html進行設計的，該工具采用了一種高效的基于圖的算法，通過將每個連續的抗原表位長度片段（即每個k-mer）視為潛在抗原表位，從而最大化病原體群體的潛在表位覆蓋范圍。通常，k=9被設定為潛在T細胞表位（PTE）的長度，因為這是大多數細胞毒性T細胞I類表位的最佳長度。在抗原設計之前，我們從GISAID下載了截至2022年11月的所有可用H9N2 HA1序列。設計過程首先將數據集中的每個序列分解為所有可能的9-mer，并計算每個9-mer在樣本群體中的頻率值（覆蓋分數）。隨后，該算法從具有最高覆蓋分數的短序列（9-mer）中組裝出一組代表性蛋白序列（Epigraph0），確保該序列包含目標病毒群體中最常見的潛在9-mer表位。對于單價疫苗，單一抗原已足夠。然而，為了進一步提高覆蓋范圍，該算法去除由Epigraph0覆蓋的表位，并生成第二個互補序列（Epigraph1）。此過程重復進行以生成第三個互補序列（Epigraph2）。Epigraph0代表最優的單一抗原，Epigraph1是最佳互補抗原，依此類推。雖然增加Epigraph序列的數量可以提高群體覆蓋范圍，但隨著越來越罕見的表位被納入，收益逐漸遞減。最終的三價Epigraph免疫原（由Epigraph0、Epigraph1和Epigraph2抗原混合而成）為群體中的潛在線性表位提供了最優覆蓋。
為了可視化三個Epigraph序列與整個群體之間的關系，我們使用MAFFT將序列與來自流感研究數據庫的6,445個獨特H9 HA1蛋白序列進行比對，并構建了最大似然（ML）系統發育樹（圖1A）。通過BLAST比對，我們在數據庫中識別出最相似的野生型序列如下：Epigraph0-A/雞/北京/XY1125/2014（序列一致性：99.7%），Epigraph1-A/雞/安徽/A3176/2014（序列一致性：90.21%），以及Epigraph2-A/雞/大阪/aq69/2001（序列一致性：90%）。為了評估Epigraph疫苗的效力，我們將其與當前推薦的候選疫苗病毒（CVV）A/安徽-廬江/39/2018（AL/39，2018年的人類分離株）進行了比較，該疫苗是世界衛生組織（WHO）于2018年推薦的候選滅活疫苗。
Production and Characterization of H9 Epigraph-mi3NPs
TH9 Epigraph-mi3納米顆粒的制備與表征。納米顆粒的尺寸對于激發免疫反應至關重要，其必須與病原體尺寸相當，才能被免疫細胞有效識別。因此，它們可作為載體，將抗原高效遞送至抗原呈遞細胞（APC），并誘導最佳的免疫激活反應。本研究采用mi3納米顆粒作為抗原展示的納米級支架，以提升免疫系統的激活效率。該支架是一種自組裝的多孔十二面體結構，由60個相同亞基構成，作為多聚化納米顆粒平臺，為免疫原性較弱的抗原提供安全且具有免疫原性的疫苗接種系統。
如先前所述，SpyTag是一種13個氨基酸的肽段，可在短時間內與其蛋白伴侶SpyCatcher（92個氨基酸）形成共價鍵（圖1B）。SpyCatcher/SpyTag系統因其簡便性、快速性及實現體外蛋白質自組裝的能力而被廣泛應用于蛋白質偶聯。因此，我們將SpyCatcher融合至mi3的N端（圖1C）。如圖1D、E所示，SpyCatcher-mi3在大腸桿菌細胞質中可溶且高效表達，并通過鎳柱親和層析及尺寸排阻色譜（SEC）進行純化。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析顯示，SpyCatcher-mi3納米顆粒呈現單一清晰條帶，SEC色譜圖中觀察到單一主峰，表明其結構均一且純度較高。負染透射電子顯微鏡（TEM）顯示，SpyCatcher-mi3組裝成預期的十二面體球形顆粒，直徑約為26 nm，略小于動態光散射（DLS）測得的流體力學直徑（圖1F、G）。為評估mi3納米顆粒的穩定性，我們進行了SDS-PAGE分析。將mi3納米顆粒在37、25、4及−80 °C下孵育1周，以評估其潛在降解情況。結果表明，mi3納米顆粒在所有測試溫度下均保持高度穩定（圖S1A），符合疫苗生產中納米顆粒支架的標準。
我們將SpyTag融合至密碼子優化的Epigraph HA基因的C端，將其克隆至pCAGGS載體中，并瞬時轉染HEK293F細胞，獲得Epigraph0-SpyTag、Epigraph1-SpyTag及Epigraph2-SpyTag抗原。SDS-PAGE分析顯示，三種Epigraph抗原均呈現單一清晰條帶，表明抗原純度較高（圖1D）。穩定性實驗表明，Epigraph抗原在37、25、4及−80 °C下孵育1周后仍保持穩定（圖S1A）。
我們將SpyTag融合到密碼子優化的Epigraph HA基因的C端，將其克隆到pCAGGS載體中，并通過瞬時轉染HEK293F細胞獲得了Epigraph0-SpyTag、Epigraph1-SpyTag和Epigraph2-SpyTag抗原。SDS-PAGE分析顯示，所有三種Epigraph抗原均呈現單一清晰的條帶，表明抗原純度較高（圖1D）。穩定性實驗表明，Epigraph抗原在37°C、25°C、4°C和−80°C下孵育1周后仍保持穩定（圖S1A）。
為制備Epigraph-mi3納米顆粒（NPs），我們首先評估了SpyCatcher-mi3與Epigraph-SpyTag在不同比例下的結合效率。結果顯示，隨著Epigraph-SpyTag量的增加，殘留的SpyCatcher-mi3逐漸減少。值得注意的是，當SpyCatcher-mi3與Epigraph-SpyTag的摩爾比達到1:4時，SpyCatcher-mi3的減少不再明顯，表明支架已達到飽和且存在過量的未結合Epigraph-SpyTag（圖S2）。基于這些發現，我們將15 μM的SpyCatcher-mi3與60 μM的Epigraph-SpyTag（mi3 NPs支架與Epigraph抗原的比例為1:4）在4°C下孵育過夜進行體外結合反應，隨后通過SEC純化去除未反應的Epigraph抗原和未結合的mi3 NPs。圖1D中的SDS-PAGE結果顯示，結合產物Epigraph-mi3呈現單一清晰的條帶，明顯大于Epigraph抗原和mi3，證實Epigraph抗原已有效結合到mi3 NPs上。這一結果在SEC色譜圖中Epigraph-mi3 NPs峰的前移中得到了進一步驗證（圖1E）。負染TEM顯示，mi3 NPs呈現規則形狀的球形顆粒，而Epigraph0-mi3 NPs表面模糊，可見明顯的突出蛋白，且直徑大于mi3 NPs。圖1F中Epigraph1-mi3和Epigraph2-mi3 NPs也觀察到類似結果。DLS分析證實了顆粒尺寸分布，Epigraph-mi3 NPs的流體動力學直徑大于未結合的mi3 NPs（圖1G）。
此外，所有 Epigraph-mi3 納米顆粒的多分散性指數（PDI）值均低于 0.5，表明 Epigraph-mi3 納米顆粒具有均勻的尺寸分布（表 S1）。
為了探究將 Epigraph 抗原偶聯到 mi3 納米顆粒上是否會影響其熱穩定性，我們將 Epigraph-mi3 納米顆粒分別在 37、25、4 和 -80 °C 下孵育 1 周。結果表明，在 -80 至 25 °C 的測試溫度范圍內，Epigraph-mi3 納米顆粒未出現顯著降解（圖 S1A）。差示掃描熒光法（DSF）結果顯示，Epigraph-mi3 納米顆粒和相應的 Epigraph 抗原表現出相似的熱穩定性，具有幾乎相同的 Tm 值，這表明 Epigraph 抗原與 mi3 蛋白的融合對其結構穩定性沒有顯著影響（圖 S1B）。由于大多數疫苗建議在冷藏條件下（2 - 8 °C）儲存，本研究構建的納米顆粒疫苗在常規疫苗儲存條件下保持了一定程度的熱穩定性。
討論
我們采用T細胞表位優化技術和基于納米顆粒的遞送系統，成功開發了Epigraph疫苗。該疫苗在小鼠模型中引發了廣譜抗體反應和強烈的細胞免疫反應，對多種H9N2毒株的致死性攻擊提供了有效保護。這些研究結果表明，Epigraph疫苗作為通用H9N2疫苗的候選者具有顯著潛力，對H9N2病毒的控制具有重要影響。
材料和方法
差示掃描熒光法（DSF）
使用PSA-16儀器（北京佰司特科技）評估目標蛋白的熱穩定性。樣品稀釋至約1 mg/mL，取20 μL稀釋樣品上樣至石英玻璃管（Cat# LG-002，京佰司特科技）。按照制造商說明進行操作。簡而言之，以1°C/min的升溫速率從30°C線性掃描至100°C，并在330 nm和350 nm波長下測量蛋白熒光強度。熱轉變中點（Tm）由F350/F330熒光比曲線的斜率確定。每個樣品測量三次。使用GraphPad Prism 9軟件繪制一階導數數據。
蛋白穩定性分析儀PSA-16
北京佰司特科技有限責任公司于2023年推出了自主研發的第一款國產的蛋白穩定性分析儀PSA-16。
PSA-16的性能和參數達到進口設備的水平，價格卻遠低于進口產品，彌補了目前國產自主設備在蛋白穩定性研究分析領域的空白。
主要參數
★ 測定參數：Tm、Cm、ΔG等；
★ 樣品通量：16個；
★ 樣品體積：≤20 uL；
★ 濃度范圍：0.01-200 mg/ml；
★ 溫控范圍：15-110度；
★ 變溫速度：0.1-15度/分鐘；
★ Tm重復性：CV小于1%；
★ 耗材參數：一次性，無需清洗；
★ 八聯排設計，適配多通道移液器；
蛋白穩定性分析儀PSA-16基于內源差示掃描熒光（ifDSF）技術，廣泛應用于蛋白質穩定性研究、蛋白質類大分子藥物（抗體）優化工程、蛋白質類疾病靶點的藥物小分子篩選和結合力測定等領域，具有快速、準確、高通量等諸多優點。蛋白質中色氨酸/酪氨酸的熒光性質與它們所處的環境息息相關，因此可以通過檢測蛋白內部色氨酸/酪氨酸在加熱或者添加變性劑過程中的熒光變化，測定蛋白質的化學和熱穩定性。
PSA-16采用紫外雙波長檢測技術，可精準測定蛋白質去折疊過程中色氨酸和酪氨酸熒光的變化，獲得蛋白的Tm值和Cm值等數據；測定時無需額外添加染料，不受緩沖液條件的限制且測試的蛋白質樣品濃度范圍非常廣（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可廣泛用于去垢劑環境中的膜蛋白和高濃度抗體制劑的穩定性研究。此外，PSA-16具有非常高的數據采集速度，從而可提供超高分辨率的數據。同時PSA-16一次最多可同時測定16個樣品，通量高；每個樣品僅需要15 uL，樣品用量少，非常適合進行高通量篩選。PSA-16操作簡單，使用后無需清洗，幾乎無維護成本。
蛋白穩定性分析儀PSA-16應用涵蓋植物、生物學、動物科學、動物醫學、微生物學、工業發酵、環境科學、農業基礎、蛋白質工程等多學科領域。蛋白質是最終決定功能的生物分子，其參與和影響著整個生命活動過程。現代分子生物學、環境科學、動醫動科、農業基礎等多種學科研究的很多方向都涉及蛋白質功能研究，以及其下游的各種生物物理、生物化學方法分析，提供穩定的蛋白質樣品是所有蛋白質研究的先決條件。因此多功能蛋白質穩定性分析系統在各學科的研究中都有基礎性意義。
1. 抗體或疫苗制劑、酶制劑的高通量篩選
2. 抗體或疫苗、酶制劑的化學穩定性、長期穩定性評估、等溫穩定性研究等
3. 生物仿制藥相似性研究（Biosimilar Evaluation）
4. 抗體偶聯藥物（ADC）研究
5. 多結構域去折疊特性研究
6. 物理和化學條件強制降解研究
7. 蛋白質變復性研究（復性能力、復性動力學等）
8. 膜蛋白去垢劑篩選，膜蛋白結合配體篩選（Thermal Shift Assay）
9. 基于靶標的高通量小分子藥物篩選（Thermal Shift Assay）
10. 蛋白純化條件快速優化等
北京佰司特科技有限責任公司 (https://www.best-sciences.com)
類器官串聯芯片培養儀—HUMIMIC；灌流式細胞組織類器官代謝分析儀—IMOLA；光片顯微鏡—LSM-200；
蛋白穩定性分析儀—PSA-16；單分子質量光度系統—TwoMP；超高速視頻級原子力顯微鏡—HS-AFM；微流控擴散測量儀—Fluidity One-M；
全自動半導體式細胞計數儀—SOL COUNT；農藥殘留定量檢測儀—BST-100；臺式原子力顯微鏡—ACST-AFM；微納加工點印儀—NLP2000DPN5000；
蛋白穩定性分析儀PSA-16（北京佰司特科技有限責任公司）助力中國科學院武漢病毒研究所科研人員成功開發出一種針對H9N2流感病毒的表位優化型納米顆粒疫苗，并于2025年6月隊在《ACS Nano》期刊發表了題為“Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H9N2 Influenza Virus”的研究論文。
Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H9N2 Influenza Virus
Mengchan Hao, Yanhai Wang, Wenxue Yang, Meng Xu, Yiwei Guan, Yuan Zhang, JianJun Chen
PMID: 40452158 DOI: 10.1021/acsnano.5c03199
摘要
H9N2禽流感病毒（AIV）對全球家禽業構成日益嚴重的威脅，并持續存在感染人類的風險。疫苗接種是預防和控制H9N2 AIV的關鍵策略。然而，病毒的持續進化不斷挑戰免疫保護的效率。因此，開發一種能夠引發廣譜免疫反應的通用H9N2流感疫苗對于疫情防控至關重要。本研究報道了一種表位優化的納米顆粒（NPs）疫苗，該疫苗能夠引發針對H9N2流感病毒的廣泛交叉反應性免疫。利用計算算法Epigraph，我們首先設計了三個具有優化表位的H9血凝素（HA1）球狀頭部。隨后，每個抗原與mi3 NPs結合，并將這三種構建體以等摩爾比例混合，生成Epigraph疫苗。我們將Epigraph疫苗與目前推薦的候選疫苗病毒（CVV）AL/39進行了比較。Epigraph疫苗在小鼠中有效誘導了交叉反應性抗體，并激活了CD4+和CD8+ T細胞免疫反應。此外，該疫苗對多種H9N2毒株的致死性攻擊提供了有效保護，并顯著降低了小鼠肺部的病毒載量。本研究為應對未來H9N2疫情提供了一種有前景的通用疫苗候選方案。
介紹
H9N2亞型禽流感病毒（AIV）于1966年首次從美國威斯康星州的火雞中分離，現已在歐亞大陸、中東和非洲國家的多種家禽中形成地方性流行，對全球家禽業造成嚴重經濟損失，并在哺乳動物和人類中引發零星感染。自1994年在中國首次分離以來，經過20多年的傳播與進化，H9N2已取代H7N9和H5N6病毒，成為中國禽類中的主要AIV亞型。目前，H9N2無需適應性突變即可直接感染人類，引發不同程度的呼吸道疾病。自1998年首次報告人類感染H9N2病例以來，2014年至2016年間，中國部分省份職業暴露人群的H9N2 AIV血清陽性率已達11.20%，表明禽類從業人員感染H9N2的風險顯著增加。
此外，自2020年以來，人類感染H9N2的病例數量顯著上升。截至目前，已有超過150人感染H9N2 AIV。系統發育分析表明，H9N2病毒是人類H5N1、H7N9、H3N8和H10N8病毒內部基因的供體，凸顯了其在新型流感病毒株出現中的關鍵作用。
近期研究表明，大多數H9N2病毒已獲得與人類型受體（α2,6唾液酸）結合的能力，這凸顯了采取有效措施預防和控制H9N2傳播的緊迫性。開發針對潛在大流行亞型的疫苗是大流行防控的關鍵策略。迄今為止，已開發出多種H9N2候選疫苗。然而，中國的H9N2病毒經歷了廣泛的基因重配，導致新基因型的不斷出現。這種持續的抗原變異顯著促進了病毒在免疫禽類中的傳播。盡管市售H9N2疫苗對匹配抗原的毒株普遍有效，但其對不匹配抗原毒株的保護效力有限。例如，1997年至2002年間分離的大多數H9N2禽流感病毒與代表性疫苗株SD/6/96相比，表現出抗原漂移。疫苗株與流行株之間的不匹配使得有效控制H9N2禽流感病毒的傳播更加復雜，凸顯了改進疫苗技術并產生針對多種H9N2流感病毒的廣泛交叉免疫的迫切需求。
Epigraph是一種高效的基于圖的算法，通過最大化所有潛在9聚體T細胞表位的覆蓋范圍來設計疫苗抗原。該算法已應用于開發治療性HIV疫苗候選物和泛絲狀病毒疫苗候選物。在小鼠和豬模型中，使用Epigraph算法設計的流感病毒候選疫苗表現出優于市售全滅活四價豬流感疫苗的交叉免疫反應。使用Epigraph算法設計的腺病毒載體疫苗已顯示出對豬H3亞型流感病毒的強保護性免疫反應。此外，計算設計的多價Epigraph血凝素疫苗在小鼠模型中表現出對乙型流感病毒的保護效力。該算法能夠高效計算設計單抗原或多抗原疫苗，最大化不同病原體群體的潛在表位覆蓋范圍，并適用于包括疫苗開發在內的抗原設計項目。
血凝素（HA）蛋白是流感病毒表面暴露的糖蛋白，是自然和疫苗介導的甲型流感病毒免疫中最具免疫原性的靶點。HA通過結合細胞表面受體并誘導膜融合啟動感染，同時也是抗流感藥物的主要靶點。位于HA蛋白球狀頭部的受體結合域已被確定為疫苗接種后引發有效中和抗體的關鍵。盡管在開發基于HA的疫苗方面做出了諸多努力，但亞單位疫苗的低免疫原性仍然是一個限制因素。為克服這一限制，已使用多種類型的納米顆粒（NPs）通過多價抗原呈遞增強流感亞單位疫苗的免疫原性，包括病毒樣顆粒（VLPs）、噬菌體、多糖和病毒體。例如，計算設計并優化的突變體i3−01（mi3）已被用作納米級支架以增強抗原免疫原性。
抗原與納米顆粒的偶聯可通過自發連接的SpyTag-SpyCatcher蛋白質共價鍵合策略實現。該系統展現出顯著的連接效率和穩定性。在本研究中，我們將三個表位優化的HA1蛋白通過SpyTag共價連接到經SpyCatcher修飾的納米顆粒上，使目標蛋白能夠輕松附著于納米顆粒表面。通過將三種納米顆粒混合，我們設計了一種Epigraph疫苗候選物。動物實驗表明，該Epigraph疫苗能夠誘導高效且廣泛的體液和細胞免疫反應，并對不同H9N2禽流感病毒株的致死性攻擊提供充分保護。本研究支持Epigraph疫苗作為通用型H9N2流感疫苗的潛在候選物。
結果
H9表位抗原的設計與開發
H9表位抗原是使用Epigraph疫苗在線設計工具https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/EPIGRAPH/epigraph.html進行設計的，該工具采用了一種高效的基于圖的算法，通過將每個連續的抗原表位長度片段（即每個k-mer）視為潛在抗原表位，從而最大化病原體群體的潛在表位覆蓋范圍。通常，k=9被設定為潛在T細胞表位（PTE）的長度，因為這是大多數細胞毒性T細胞I類表位的最佳長度。在抗原設計之前，我們從GISAID下載了截至2022年11月的所有可用H9N2 HA1序列。設計過程首先將數據集中的每個序列分解為所有可能的9-mer，并計算每個9-mer在樣本群體中的頻率值（覆蓋分數）。隨后，該算法從具有最高覆蓋分數的短序列（9-mer）中組裝出一組代表性蛋白序列（Epigraph0），確保該序列包含目標病毒群體中最常見的潛在9-mer表位。對于單價疫苗，單一抗原已足夠。然而，為了進一步提高覆蓋范圍，該算法去除由Epigraph0覆蓋的表位，并生成第二個互補序列（Epigraph1）。此過程重復進行以生成第三個互補序列（Epigraph2）。Epigraph0代表最優的單一抗原，Epigraph1是最佳互補抗原，依此類推。雖然增加Epigraph序列的數量可以提高群體覆蓋范圍，但隨著越來越罕見的表位被納入，收益逐漸遞減。最終的三價Epigraph免疫原（由Epigraph0、Epigraph1和Epigraph2抗原混合而成）為群體中的潛在線性表位提供了最優覆蓋。
為了可視化三個Epigraph序列與整個群體之間的關系，我們使用MAFFT將序列與來自流感研究數據庫的6,445個獨特H9 HA1蛋白序列進行比對，并構建了最大似然（ML）系統發育樹（圖1A）。通過BLAST比對，我們在數據庫中識別出最相似的野生型序列如下：Epigraph0-A/雞/北京/XY1125/2014（序列一致性：99.7%），Epigraph1-A/雞/安徽/A3176/2014（序列一致性：90.21%），以及Epigraph2-A/雞/大阪/aq69/2001（序列一致性：90%）。為了評估Epigraph疫苗的效力，我們將其與當前推薦的候選疫苗病毒（CVV）A/安徽-廬江/39/2018（AL/39，2018年的人類分離株）進行了比較，該疫苗是世界衛生組織（WHO）于2018年推薦的候選滅活疫苗。
Production and Characterization of H9 Epigraph-mi3NPs
TH9 Epigraph-mi3納米顆粒的制備與表征。納米顆粒的尺寸對于激發免疫反應至關重要，其必須與病原體尺寸相當，才能被免疫細胞有效識別。因此，它們可作為載體，將抗原高效遞送至抗原呈遞細胞（APC），并誘導最佳的免疫激活反應。本研究采用mi3納米顆粒作為抗原展示的納米級支架，以提升免疫系統的激活效率。該支架是一種自組裝的多孔十二面體結構，由60個相同亞基構成，作為多聚化納米顆粒平臺，為免疫原性較弱的抗原提供安全且具有免疫原性的疫苗接種系統。
如先前所述，SpyTag是一種13個氨基酸的肽段，可在短時間內與其蛋白伴侶SpyCatcher（92個氨基酸）形成共價鍵（圖1B）。SpyCatcher/SpyTag系統因其簡便性、快速性及實現體外蛋白質自組裝的能力而被廣泛應用于蛋白質偶聯。因此，我們將SpyCatcher融合至mi3的N端（圖1C）。如圖1D、E所示，SpyCatcher-mi3在大腸桿菌細胞質中可溶且高效表達，并通過鎳柱親和層析及尺寸排阻色譜（SEC）進行純化。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析顯示，SpyCatcher-mi3納米顆粒呈現單一清晰條帶，SEC色譜圖中觀察到單一主峰，表明其結構均一且純度較高。負染透射電子顯微鏡（TEM）顯示，SpyCatcher-mi3組裝成預期的十二面體球形顆粒，直徑約為26 nm，略小于動態光散射（DLS）測得的流體力學直徑（圖1F、G）。為評估mi3納米顆粒的穩定性，我們進行了SDS-PAGE分析。將mi3納米顆粒在37、25、4及−80 °C下孵育1周，以評估其潛在降解情況。結果表明，mi3納米顆粒在所有測試溫度下均保持高度穩定（圖S1A），符合疫苗生產中納米顆粒支架的標準。
我們將SpyTag融合至密碼子優化的Epigraph HA基因的C端，將其克隆至pCAGGS載體中，并瞬時轉染HEK293F細胞，獲得Epigraph0-SpyTag、Epigraph1-SpyTag及Epigraph2-SpyTag抗原。SDS-PAGE分析顯示，三種Epigraph抗原均呈現單一清晰條帶，表明抗原純度較高（圖1D）。穩定性實驗表明，Epigraph抗原在37、25、4及−80 °C下孵育1周后仍保持穩定（圖S1A）。
我們將SpyTag融合到密碼子優化的Epigraph HA基因的C端，將其克隆到pCAGGS載體中，并通過瞬時轉染HEK293F細胞獲得了Epigraph0-SpyTag、Epigraph1-SpyTag和Epigraph2-SpyTag抗原。SDS-PAGE分析顯示，所有三種Epigraph抗原均呈現單一清晰的條帶，表明抗原純度較高（圖1D）。穩定性實驗表明，Epigraph抗原在37°C、25°C、4°C和−80°C下孵育1周后仍保持穩定（圖S1A）。
為制備Epigraph-mi3納米顆粒（NPs），我們首先評估了SpyCatcher-mi3與Epigraph-SpyTag在不同比例下的結合效率。結果顯示，隨著Epigraph-SpyTag量的增加，殘留的SpyCatcher-mi3逐漸減少。值得注意的是，當SpyCatcher-mi3與Epigraph-SpyTag的摩爾比達到1:4時，SpyCatcher-mi3的減少不再明顯，表明支架已達到飽和且存在過量的未結合Epigraph-SpyTag（圖S2）。基于這些發現，我們將15 μM的SpyCatcher-mi3與60 μM的Epigraph-SpyTag（mi3 NPs支架與Epigraph抗原的比例為1:4）在4°C下孵育過夜進行體外結合反應，隨后通過SEC純化去除未反應的Epigraph抗原和未結合的mi3 NPs。圖1D中的SDS-PAGE結果顯示，結合產物Epigraph-mi3呈現單一清晰的條帶，明顯大于Epigraph抗原和mi3，證實Epigraph抗原已有效結合到mi3 NPs上。這一結果在SEC色譜圖中Epigraph-mi3 NPs峰的前移中得到了進一步驗證（圖1E）。負染TEM顯示，mi3 NPs呈現規則形狀的球形顆粒，而Epigraph0-mi3 NPs表面模糊，可見明顯的突出蛋白，且直徑大于mi3 NPs。圖1F中Epigraph1-mi3和Epigraph2-mi3 NPs也觀察到類似結果。DLS分析證實了顆粒尺寸分布，Epigraph-mi3 NPs的流體動力學直徑大于未結合的mi3 NPs（圖1G）。
此外，所有 Epigraph-mi3 納米顆粒的多分散性指數（PDI）值均低于 0.5，表明 Epigraph-mi3 納米顆粒具有均勻的尺寸分布（表 S1）。
為了探究將 Epigraph 抗原偶聯到 mi3 納米顆粒上是否會影響其熱穩定性，我們將 Epigraph-mi3 納米顆粒分別在 37、25、4 和 -80 °C 下孵育 1 周。結果表明，在 -80 至 25 °C 的測試溫度范圍內，Epigraph-mi3 納米顆粒未出現顯著降解（圖 S1A）。差示掃描熒光法（DSF）結果顯示，Epigraph-mi3 納米顆粒和相應的 Epigraph 抗原表現出相似的熱穩定性，具有幾乎相同的 Tm 值，這表明 Epigraph 抗原與 mi3 蛋白的融合對其結構穩定性沒有顯著影響（圖 S1B）。由于大多數疫苗建議在冷藏條件下（2 - 8 °C）儲存，本研究構建的納米顆粒疫苗在常規疫苗儲存條件下保持了一定程度的熱穩定性。
討論
我們采用T細胞表位優化技術和基于納米顆粒的遞送系統，成功開發了Epigraph疫苗。該疫苗在小鼠模型中引發了廣譜抗體反應和強烈的細胞免疫反應，對多種H9N2毒株的致死性攻擊提供了有效保護。這些研究結果表明，Epigraph疫苗作為通用H9N2疫苗的候選者具有顯著潛力，對H9N2病毒的控制具有重要影響。
材料和方法
差示掃描熒光法（DSF）
使用PSA-16儀器（北京佰司特科技）評估目標蛋白的熱穩定性。樣品稀釋至約1 mg/mL，取20 μL稀釋樣品上樣至石英玻璃管（Cat# LG-002，京佰司特科技）。按照制造商說明進行操作。簡而言之，以1°C/min的升溫速率從30°C線性掃描至100°C，并在330 nm和350 nm波長下測量蛋白熒光強度。熱轉變中點（Tm）由F350/F330熒光比曲線的斜率確定。每個樣品測量三次。使用GraphPad Prism 9軟件繪制一階導數數據。
蛋白穩定性分析儀PSA-16
北京佰司特科技有限責任公司于2023年推出了自主研發的第一款國產的蛋白穩定性分析儀PSA-16。
PSA-16的性能和參數達到進口設備的水平，價格卻遠低于進口產品，彌補了目前國產自主設備在蛋白穩定性研究分析領域的空白。
主要參數
★ 測定參數：Tm、Cm、ΔG等；
★ 樣品通量：16個；
★ 樣品體積：≤20 uL；
★ 濃度范圍：0.01-200 mg/ml；
★ 溫控范圍：15-110度；
★ 變溫速度：0.1-15度/分鐘；
★ Tm重復性：CV小于1%；
★ 耗材參數：一次性，無需清洗；
★ 八聯排設計，適配多通道移液器；
蛋白穩定性分析儀PSA-16基于內源差示掃描熒光（ifDSF）技術，廣泛應用于蛋白質穩定性研究、蛋白質類大分子藥物（抗體）優化工程、蛋白質類疾病靶點的藥物小分子篩選和結合力測定等領域，具有快速、準確、高通量等諸多優點。蛋白質中色氨酸/酪氨酸的熒光性質與它們所處的環境息息相關，因此可以通過檢測蛋白內部色氨酸/酪氨酸在加熱或者添加變性劑過程中的熒光變化，測定蛋白質的化學和熱穩定性。
PSA-16采用紫外雙波長檢測技術，可精準測定蛋白質去折疊過程中色氨酸和酪氨酸熒光的變化，獲得蛋白的Tm值和Cm值等數據；測定時無需額外添加染料，不受緩沖液條件的限制且測試的蛋白質樣品濃度范圍非常廣（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可廣泛用于去垢劑環境中的膜蛋白和高濃度抗體制劑的穩定性研究。此外，PSA-16具有非常高的數據采集速度，從而可提供超高分辨率的數據。同時PSA-16一次最多可同時測定16個樣品，通量高；每個樣品僅需要15 uL，樣品用量少，非常適合進行高通量篩選。PSA-16操作簡單，使用后無需清洗，幾乎無維護成本。
蛋白穩定性分析儀PSA-16應用涵蓋植物、生物學、動物科學、動物醫學、微生物學、工業發酵、環境科學、農業基礎、蛋白質工程等多學科領域。蛋白質是最終決定功能的生物分子，其參與和影響著整個生命活動過程。現代分子生物學、環境科學、動醫動科、農業基礎等多種學科研究的很多方向都涉及蛋白質功能研究，以及其下游的各種生物物理、生物化學方法分析，提供穩定的蛋白質樣品是所有蛋白質研究的先決條件。因此多功能蛋白質穩定性分析系統在各學科的研究中都有基礎性意義。
1. 抗體或疫苗制劑、酶制劑的高通量篩選
2. 抗體或疫苗、酶制劑的化學穩定性、長期穩定性評估、等溫穩定性研究等
3. 生物仿制藥相似性研究（Biosimilar Evaluation）
4. 抗體偶聯藥物（ADC）研究
5. 多結構域去折疊特性研究
6. 物理和化學條件強制降解研究
7. 蛋白質變復性研究（復性能力、復性動力學等）
8. 膜蛋白去垢劑篩選，膜蛋白結合配體篩選（Thermal Shift Assay）
9. 基于靶標的高通量小分子藥物篩選（Thermal Shift Assay）
10. 蛋白純化條件快速優化等
北京佰司特科技有限責任公司 (https://www.best-sciences.com)
類器官串聯芯片培養儀—HUMIMIC；灌流式細胞組織類器官代謝分析儀—IMOLA；光片顯微鏡—LSM-200；
蛋白穩定性分析儀—PSA-16；單分子質量光度系統—TwoMP；超高速視頻級原子力顯微鏡—HS-AFM；微流控擴散測量儀—Fluidity One-M；
全自動半導體式細胞計數儀—SOL COUNT；農藥殘留定量檢測儀—BST-100；臺式原子力顯微鏡—ACST-AFM；微納加工點印儀—NLP2000DPN5000；
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