病毒樣顆粒疫苗及其純化工藝簡介
疫苗接種是預防和控制傳染病傳播最具效益的方法之一。病原體及其代謝物被制備成一種免疫制劑，可通過人工衰減、解毒、失活或基因工程等方法實現傳染病防控[1]。傳統疫苗，包括減毒活疫苗和滅活疫苗，可在宿主細胞中引起強烈和長期有效的免疫反應，因此在疫苗市場上占有突出地位。
出于對傳統疫苗潛在病原性、難以生產等因素的考慮，一些新型疫苗，特別是基于病毒樣顆粒（Virus-Like Particles，VLPs）的基因工程疫苗，因具有更強的免疫原性和安全性而受到廣泛關注（Fig.1）[2]。
Fig.1 疫苗分類
從結構上來說，VLPs可以分為無包膜VLP 與有包膜VLP（Fig.2），VLP疫苗甚至可構建雙層、三層包膜，實現多價疫苗與多聯疫苗的效果。
無包膜VLPs，如HPV、HEV等疫苗，結構相對簡單，可在原核系統或真核系統中表達，尤其是表達量高和易放大的大腸桿菌與酵母表達系統。
包膜VLPs結構復雜，需要宿主膜參與構建，可選擇在酵母、昆蟲細胞以及植物細胞等真核系統中表達[3]。不同的表達系統在VLP的含量和完整VLP的比率上有差異，進而影響免疫原性。
Fig.2 無包膜VLPs與包膜VLPs
Table 1.已上市的病毒顆粒樣疫苗
乙型肝炎病毒（HBV）是乙型肝炎的主要病原，屬于包膜DNA病毒，包含由脂質和三種包膜蛋白組成的外膜。目前，疫苗接種是預防HBV感染最有效的方法[4]。
迄今為止，HBV的VLP疫苗已經開發了三代。Heptavax-B是一代疫苗，該疫苗是從乙肝患者血樣中分離得到乙肝表面抗原顆粒，屬于滅活疫苗。
出于對一代疫苗安全性和來源不確定性的考慮，第二代基于HBV VLPs的基因工程疫苗Recombivax HB（MSD）和Engerix-B（GSK）獲批上市，兩者均使用釀酒酵母系統表達HBsAg（具有規則的正二十面體對稱結構）。2018年，在漢遜酵母中表達的含有重組HBsAg及兼具Toll-like receptor 9激動劑佐劑的新型乙肝疫苗Heplisav-B批準上市，其免疫原性高于Engerix-B（接種3針，每針間隔6個月），僅接種2針即可（每針間隔1個月）。
第二代疫苗僅含有單一抗原（Small S Antigen of HBsAg），疫苗實現血清保護的時間長。因此，為提高乙肝疫苗的有效性和保護效力，第三代疫苗Sci-B-Vac（PreHevBrio）在CHO細胞中表達了三種HBV表面抗原（S, pre-S1 and pre-S2），混合了糖基化和非糖基化HBsAg的VLPs，更接近天然結構而具有更高的免疫原性[5]。
Table 2.二代、三代乙肝疫苗對比
宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第二大常見原因，全世界約70%的宮頸癌由高危HPV亞型16和18導致。
四價Gardasil（MSD）是第一個被批準作為人乳頭瘤病毒（HPV）預防性的疫苗。在酵母中表達得到的重組蛋白L1自組裝成VLP，主要為HPV 6/11/16/18這四種HPV類型引起的病毒感染提供保護。2014年，默沙東公司進一步推出的九價疫苗Gardasil-9，有著更高的總抗原量和鋁佐劑含量，除了Gardasil提供的預防HPV 6/11/16/18病毒之外，該疫苗還對HPV 31/33/45/52/58病毒具有額外的預防作用。
2009年，FDA批準了一種名為Cervarix（GSK）的二價疫苗。該疫苗采用桿狀病毒昆蟲細胞表達系統，主要靶向HPV 16/18，因為Cervarix擁有一種新型的AS04佐劑系統，對HPV 16/18具有更好的免疫原性和長期保護作用。
2019年12月，馨可寧正式獲得國家醫藥品監督管理局批準在中國使用，用于HPV 16/18預防。相比酵母和昆蟲/桿狀病毒表達系統，馨可寧應用的大腸桿菌（E.coli）表達體系可以節省成本。
同樣用于預防HPV 16/18的沃澤惠于2022年5月在中國批準上市，該疫苗則由畢赤酵母表達。
Fig.3 HPV疫苗[6]
截至2022年12月31日，中國正處于臨床研究階段的人乳頭瘤病毒疫苗共有20種。其中瑞科生物、萬泰生物、沃森生物、博唯生物、康樂衛士的九價HPV疫苗以及相關產品已進入Ⅲ期臨床階段[7]。
人乳頭瘤病毒含有兩種病毒編碼的蛋白質，分別為 L1 和 L2。這兩種蛋白質形成二十面體衣殼， L1 是主要的結構蛋白。目前，已上市的預防性HPV疫苗都是基于僅含有L1蛋白的自組裝VLPs，因為L1蛋白是病毒的主要結構蛋白，可以自組裝成具有高免疫原性的VLPs，能夠誘導強烈的類型特異性免疫應答。微小衣殼蛋白L2作為HPV類型中高度保守的蛋白，被認為是開發下一代泛HPV疫苗的合適靶點。
Schellenbacher等人構建了一種同時表達L1和L2蛋白的嵌合HPV疫苗（HPV 16 L1-HPV 16 L2），并在佐劑誘導下針對HPV 16產生廣譜中和抗體[8]。
Fig.4 HPV 結構蛋白
HEV是一種非包膜單鏈RNA病毒，其基因組包含3個開放閱讀框，ORF2編碼唯一的結構蛋白。廈門萬泰生物技術有限公司研制的基于截斷的pORF2的HEV239 （Hecolin）于2012年在中國獲批，該疫苗由大腸桿菌表達，是全球首個且唯一的戊肝疫苗。
VLPs表達系統的多樣性也導致下游純化工藝不具有普適性。Fig. 5為一般下游工藝流程圖[9]。
Fig.5 VLP疫苗的下游工藝流程
純化包括粗純、中間純化及精純等階段。色譜法是VLPs下游工藝的核心操作單元，包括親和層析、離子層析、疏水層析、分子篩層析以及復合模式層析。
Fig.6 VLPs純化技術
Fig.7 CHO細胞與酵母表達系統制備HBsAg工藝流程
國內乙肝疫苗有三種技術路線（Fig.7），分別是CHO細胞、漢遜酵母和釀酒酵母。酵母細胞在制備HBsAg時多為胞內表達，需收獲裂解后澄清，疏水捕獲（HBsAg蛋白的疏水鍵可與疏水配基結合），流穿模式下陰離子去除大量HCP等雜質，分子篩精純去除小分子雜質。而CHO細胞表達系統多為胞外表達，料液中含少量HCP，無需裂解過程。CHO含糖基化HBsAg，更接近天然結構，純化過程與酵母表達系統相比簡單，可在粗純階段選擇疏水作用相對較弱的填料。
博格隆提供系列疏水填料，Diamond HIC系列及Diamond HIC Mustang系列填料是以高剛性瓊脂糖為基架偶聯相對應的疏水基團，反壓低、流速快，適合生物分子的大規模分離純化。
Fig.8 Diamond Butyl填料
Fig.9 HPV疫苗純化工藝流程
上市HPV疫苗源于大腸桿菌、酵母以及桿狀病毒/昆蟲細胞三種表達系統（Fig.9），下游純化工藝一般以強陽離子捕獲。
博格隆MegaPoly 50 HS具有特殊的孔徑結構，較大的貫穿孔和擴散孔可在提供高動態載量的同時降低擴散對層析的影響，賦予產品高流速、高載量、高分辨率的特性，在捕獲階段提供更快速，更高效的分離純化選擇。后續通過羥基磷灰石（CHT Ⅱ）、離子或疏水層析進行精純。純化過程中，大腸桿菌表達系統需注意去除內毒素，桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統需注意去除重組桿狀病毒（BV）基因組及HCD。離子交換可顯著去除HCP、HCD以及大腸內毒素，不同粒徑的離子交換介質可應用于捕獲或精純階段。
博格隆Diamond IEX系列填料是將離子交換基團偶聯到帶有葡聚糖長鏈的高剛性瓊脂糖上，延伸臂增加配基密度從而提高蛋白載量，高效分離純化蛋白。
Fig.10 Diamond DEAE（左）與Diamond Q（右）填料
多模式層析因為能同時提供不同類型的相互作用力，所以在 VLPs 純化工藝開發中占據優勢地位。
博格隆Diamond Layer 400和Diamond Layer 700是新型的多模式純化層析介質，分子量排阻分別為400KD和700KD，其雙層結構由具有陰離子和疏水作用的核心微球及具有分子篩作用的薄層鈍化外殼（一層不帶配基的瓊脂糖）組成。小于對應分子量的雜質進入微球內部與配基基團結合，病毒顆粒會被阻隔在微球外。因此，相對于傳統分子篩，其最大的優勢在于上樣量大大提高，且在放大過程中可有效減小柱體積。該類介質專為病毒和其它生物大分子的中間純化和精細純化而設計，是疫苗生產中病毒純化介質的極佳選擇。
Fig.11 博格隆Diamond Layer 700多模式層析填料
為了提高疫苗質量，所有表達系統均需進行解聚再復聚的步驟。因為雜質除了位于顆粒表面外，還可能結合在顆粒內部，解聚狀態下純化可更徹底地去除HCP與HCD。
天然HPV顆粒含有L1蛋白與L2蛋白，而目前HPV疫苗不含L2蛋白，導致在組裝過程中出現顆粒不均一的情況，因此解聚后復聚可以使顆粒均一，增強免疫原性。解聚可以在層析過程中添加適量DTT，后續復聚前需置換緩沖液去除還原劑。
為達到更好的VLPs 疫苗純化效果，下游純化應根據目的抗原的性質及表達體系的復雜性選擇合適的層析方式，并搭配膜層析技術提高免疫原性和安全性。
參考文獻
[1] Recent Progress on the Versatility of Virus-Like Particles. VACCINE, 2020, 8, 139.
[2] Production of virus-like particles for vaccines. NEW BIOTECHNOLOGY, 39 , pp.174-180.
[3] Bioengineering Virus-Like Particles as Vaccines. BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,111 (3) , pp.425-440.
[4] Hepatitis B vaccine development and implementation. HUMAN VACCINES &IMMUNOTHERAPEUTICS, 16 (7) , pp.1533-1544.
[5] Virus-like particle vaccinology, from bench to bedside. CELLULAR & MOLECULAR IMMUNOLOGY ,19 (9) , pp.993-1011
[6] An Update on Human Papilloma Virus Vaccines History Types Protection and Efficacy. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY,12
[7] 人用疫苗市場發展現狀與未來趨勢研究報告.
[8] Chimeric L1-L2 virus-like particles as potential broad-spectrum human papillomavirus vaccines. JOURNAL OF VIROLOGY, 83 (19) , pp.10085-10095.
[9] Next generation vaccines and vectors: Designing downstream processes for recombinant protein-based virus-like particles. BIOTECHNOLOGY JOURNAL, 10 (5) , pp.715-U100.
