植物活體成像助力發現NRPD4與RNA聚合酶IV和V的關系
導讀：RNA指導DNA甲基化（RdDM）是一種基于RNAi的植物轉錄沉默機制。植物特異性RNA聚合酶IV和V分別產生24-核苷酸（nt）siRNAs和引導siRNA特異性序列DNA甲基化所必須的。
2009年朱健康團隊發表在《GENES & DEVELOPMENT》中題為“NRPD4,a protein related to the RPB4 subunit of RNA polymerase II,is a component of RNA polymerases IV and V and is required for RNA-directed DNA methylation”研究論文，結果表明：RDM2/NRPD4/NRPE4是擬南芥RdDM途徑的一個新的組成部分，它作為Pol IV和PolV的一部分起作用。
https://genesdev.cshlp.org/content/23/3/318
研究背景
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DNA甲基化是一種表觀遺傳學標記，保存在植物、哺乳動物和一些真菌中。它在表觀遺傳過程中發揮重要作用，如轉基因和內源基因的穩定轉錄沉默、參數化、印跡和X失活。在植物中，24核苷酸（nt）siRNAs可以指導序列特異性DNA甲基化。哺乳動物細胞中，piwi-interacting small RNAs（piRNAs）和某些內源性siRNAs也可以指導DNA甲基化。在裂殖酵母中，沒有DNA甲基化，但是siRNAs仍然可以通過指導異染色組蛋白修飾來觸發轉錄基因沉默（TGS）。
植物異染色質siRNAs長度為24nt，其產生途徑依賴于RNA依賴的RNA聚合酶2（RDR2）和Dicer-like3（DCL 3）。該途徑還需要PolIV，一種植物特有的，推測為DNA依賴性RNA聚合酶。有趣的是，siRNAs的功能不僅取決于效應蛋白Argonaute 4（AGO4）,染色質重塑蛋白DRD1和新的DNA甲基化轉移酶DRM2，還取決于另一種植物特有的推測為DNA依賴性RNA聚合酶Pol IVb/PolV。PolIV被推測為轉錄甲基化DNA，以產生作為RDR2底物的初始轉錄物。然而，無論在體內還是體外這種活性尚未得到證實。最近，PolV和DRD1被發現是產生無帽和非聚腺苷化RNAs所必需的，這些RNAs可以作為異染色質siRNAs結合的支架，而異染色質siRNAs是DNA甲基化的特異性向導。
在ros1突變體中，nrpd4-1突變抑制TGS
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除了已知的7個基因突變體外，一種新的突變體rdm2-1（后來被重命名為nrpd4-1或nrpe4-1）也被鑒定為ros1抑制因子。圖2A顯示了野生型、ros1和ros1nrpd-1的發光表型。結果顯示，經過冷處理后，ros1nrpd4-1發出的發光強與ros1相比，盡管其發光仍弱于野生型。結果表明，ros1中的RD29A-LUC的沉默部分受到nrpd4突變抑制。
ros1nrpd4-1植株的發光表型表明，nrpd4-1突變抑制了RD29A-LUC轉基因的TGS。Northern blot檢測顯示，內源性RD29A mRNA水平高于ros1，但低于野生型（圖2B）。這些結果表明，nrpd4-1突變部分抑制了RD29A-LUC轉基因和內源性RD29A基因的沉默。野生型、ros1和ros1nrpd4-1植株在18S rRNA負載控制或冷脅迫誘導的COR15A基因冷處理控制方面沒有差別（圖2B）。綜上所述，這些結果表明nrpd4-1突變部分抑制內源RD29A和RSD29A-LUC轉基因的TGS。
TGS在ros1nrpd4-1突變體中受到抑制
NRPD4/NRPE4與NRPD1和NRPE1相互作用
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由于NRPD4/NRPE4和PRB4之間的高度相似，以及我們發現NRPD4/NRPE4在RdDM通路中的功能，我們想知道NRPD4是否可能是POl IV和/或Pol V的一個功能亞基，我們進行了免疫共沉淀實驗來檢測NRPD4/NRPE4與POl IV或Pol V的最大亞基的關聯。從NRPD1-Flag轉基因植株、NPRE1-Flag轉基因植株或未轉基因的野生型植株中提取蛋白質與抗NRPD4/NRPE4抗體孵育，然后用蛋白A瓊脂糖珠沉淀。將結合蛋白復合物洗滌后洗脫，用抗Flag抗體進行Western blot分析，檢測NRPD1a/NRPD1或NRPD1b/NRPE1是否與NRPD4/NRPE4免疫共沉淀。分析顯示NRPD1-Flag（圖8A）和NRPE1-Flag（圖8B）都可以被NRPD4/NRPE4抗體共沉淀。結果表明，NRPD4/NRPE4在體內可以與NRPD1和NRPE1相互作用。因此，NRPD4/NRPE4可能在POl IV和Pol V中作為亞基起作用。
NRPD4/NRPE4與NRPD1和NRPE1相互作用
研究結果
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證明了RDM2不是RPB4的直系同源，相反，它是PolIV和PolV的一部分；Pol IV和PolV是多亞基酶，NRPD4/NRPE4亞基是從PolII的祖先RPB4亞基進化而來的，但是已經分化為承擔RdDM途徑的特定功能。
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植物突變體篩選（低溫CCD相機檢測）、RNA印跡、酵母雙雜交、DNA甲基化測定、RT-PCR分析、免疫共沉淀和免疫印跡法、免疫染色等。
小編感悟：初次寫類似文字，自身有很多不足，會在今后努力提高的。欲善其事，必先利其器。新基因、機制的發現，不只是需要專業的人才，嚴謹的實驗設計，專業的檢測設備也是不可缺少的。
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