技術干貨介紹：詳解病毒示蹤技術及其注射方法

病毒載體概述

根據病毒載體使用目的可將病毒載體劃分為兩類：一種是廣泛應用于科研的“基因表達載體”，另一種“基因治療載體”則應用于臨床居多。病毒載體具有保留病毒高效感染、轉染能力以及去除或減少病毒病理功能基因的特征。現在被使用的病毒載體被稱為“重組病毒載體”。

重組病毒載體包含三大特征：

• 去除大多數病毒功能的基因
• 保留病毒顆粒包裝序列
• 外源基因和外源基因輔助序列

（圖片來源：http://www.addgene.org/viral-vectors/）

重組病毒構建的模式首先應保證：組裝與復制序列不在同一個質粒上，并且最終組裝病毒所包裹的基因組序列只含表達的外源基因以及外源基因的輔助片段，不可包含控制病毒復制的序列。如果包裝出來的新一代病毒，仍然具有復制序列，那么它的生物安全性會存在巨大的隱患。因此“重組病毒”又可稱為 “復制功能缺陷重組病毒”。

病毒載體直接注入
中樞神經系統及其表達分析

目前，病毒載體在實驗室神經科學活體研究中，通常是應用病毒直接注射的方式注射到目標腦區，然后再進行后續研究。病毒表達的鑒定包括：鑒定基因表達、鑒定蛋白表達和鑒定神經元亞型，具體參考下圖所示。

（圖片來源：C.N. Cearley.J.H.Wolfe.2006)

病毒載體在
中樞神經系統中的傳遞模式

根據我們注射方式的不同，病毒載體在中樞神經系統中的傳遞模式和表達方式也不盡相同。使用立體定位儀注射模式大多數會產生垂直的孔，注射理想狀態是產生球型擴散，實際情況由于操作精度及針頭停留時間的一個情況影響最后擴散的模式往往是沿著注射孔徑分布。軸突注射模式主要沿軸突傳遞。腦室/脊髓注射模式則沿腔壁分布。血管注射模式會沿血管網分布。
 

（圖片來源：M. Simonato, et al., 2013.）

實驗室常用的病毒載體

常用的病毒載體分類為：CMV質粒、EBV質粒。逆轉錄病毒載體為：皰疹病毒 、腺病毒、腺相關病毒、狂犬病毒。關于病毒載體的優劣勢如下圖所見：

• Lentivirus（慢病毒）中編碼為RNA，裝載序列容量小于8KB，產生的免疫反應較低。
• AAV（腺相關病毒）的劣勢在于裝載容量偏小只有4.5KB，它的優勢在于免疫反應非常低，利于動物后期的快速恢復及后續的神經科學研究。
• Adenovirus（腺病毒）優點是裝載容量很大，缺點是造成免疫反應很強。

▲（圖片來源：https://www.addgene.org/guides）

病毒載體的具體分析

• 慢病毒（Lentivirus）

慢病毒是一種逆轉入病毒，它是RNA逆轉為雙鏈DNA整合到宿主細胞基因組。質粒來源廣泛，主要來源于免疫缺陷病毒，比較常用的有HIV-1。慢病毒（Lentivirus）具有的一大特點是廣泛細胞感染能力，無論是神經元、膠質細胞、還是神經干細胞均可感染，在Lentivirus包裝過程中它的膜蛋白VSV-G必須要放在包裝質粒當中，出于對Lentivirus生物安全性的考慮，我們把真正轉入的目標外源基因的序列包裝在轉染質粒上。具體可參考下圖：
 

 

• 腺病毒（Adenovirus）

腺病毒基因組的容量特別大（36KB），是DNA類型病毒。在DNA序列當中，目前通常將E1替換為外源基因，由于E1基因對于腺病毒的生命周期是很重要的，替換掉后只能把改造后的腺病毒基因導入到穩定表達E1蛋白中HEK293細胞中包裝。包裝完成所產生的病毒溶液會導致一定程度的炎癥反應，容易對神經元造成水腫，對后續的行為學研究、形態學研究產生很大的影響，應用神級科學手術存在比較明顯的缺陷，因此不適合作為基因治療載體。
 

• 腺相關病毒（Adeno-Associated Virus）

腺相關病毒是48KB單鏈的DNA，基因組包括Rep編碼的AAV生命周期相關蛋白 、Cap編碼的AAV衣殼蛋白兩個開放閱讀框，另外需要helper plasmid編碼AAV復制相關蛋白，待三個質粒全部轉染進入HEK293細胞后，便可包裝成為具有感染能力，但無復制能力的AAV病毒顆粒。

（圖片來源：Jacqueline Hunter et al., 2017）
 

• 重組腺相關病毒（recombinant AAV, rAAV）

重組腺相關病毒是目前已發現的結構簡單的一類單鏈DNA復制缺陷型病毒，具有安全性高、免疫原性低、宿主細胞范圍廣和在體內表達時間長等特點。科學界現普遍認為AAV不會導致人類疾病，是目前最有前景的基因治療載體。基因工程化的AAV能轉導外源基因，借助特定啟動子、光遺傳學/化學遺傳學元件、鈣指示劑、神經遞質探針或Cre/lox P，Flp／FRT重組酶技術，可選擇性地標記特定的神經元。可根據感染對象細胞有針對選擇不同AAV的血清型，越來越多的神經環路研究使用AAV作為神經示蹤工具。
 

（圖片來源：https://www.addgene.org/guides/aav/）
 

• 狂犬病毒Rabies Virus

狂犬病毒不同于其它病毒載體，不可以作為廣普的病毒載體感染各類細胞。作為神經科學研究的工具，狂犬病毒被應用的點在于其神經專嗜性（neurotropic viruses）。野生型狂犬病毒細胞內高拷貝數具有細胞病毒，可逆行多級神經元影響環路研究分析。產生移除糖蛋白G，重組SAD△G-GFP狂犬病毒不能逆行感染神經元。后來通過產生引入外源膜蛋白EnVA重組EnVA-SAD△G-GFP特異感染表達受體TVA的細胞進行感染。
 

病毒的注射與表達

• 準備工具

瑞沃德71000全自動腦立體定位儀、R-480玻璃微電極注射泵及MP-500微電極拉制儀拉制出的電極來共同使用：
 

 

• 病毒注射流程

將小鼠誘導麻醉后套好麻醉面罩，進行頭部固定，在立體定位儀上切開頭頂皮膚，清理顱骨表面。
 

 

病毒注射前需將小鼠的頭部調平，調整鼻夾和耳肝Z軸高度，使小鼠顱骨表面前后左右Z軸高度一致。
 

根據目標腦區的立體定位圖譜坐標進行調整，用顱骨鉆鉆開小鼠顱骨，用針尖挑破硬腦膜。
 

• 模式設置與速度選擇

四種組合工作方式：注射、抽吸、注射/抽吸、抽吸/注射。

流量速率設置可達到PI級別，時間參數Hr/Min/Sec都可選，病毒注射速率控制在20nl/min-40nl/min。

設置速率后，可以選擇定時或定量注射。
 

注射/抽吸過程，可以實時觀察當前狀態。
 

玻璃微電極的尖端插入到目標腦區的坐標深度，注射完畢后電極停留10min,縫合傷口并將動物放回籠內。

新一代的示蹤方法——病毒載體具有突出優勢。病毒載體采用改造后的病毒，安全性高、毒性低、能轉入目的基因且選擇范圍廣。依據其特性可供研究者自由組合使用。科學家們一直努力研究改造病毒，以期獲得毒性更低，感染、傳播、跨突觸機制更加明確的神經示蹤工具病毒，為腦科學研究提供更強大的工具。