核酸提取解決方案具體實驗步驟

瀏覽次數：3483　發布日期：2022-12-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

核酸提取

核酸提取是指將核酸（DNA和RNA）從細胞中提取出來的過程，基本包括細胞裂解（Lysis）、雜質與產物分離（Precipitation）、清洗產物（Wash）及產物重懸（Resuspension）的過程。

提取的效果與產物質量控制可以通過后續核酸濃度、純度測定來實現。根據原始樣品的種類和核酸產物后續的各種應用目的，細胞裂解和核酸純化步驟有不同的處理方法和要求。

實驗室中的DNA提取

DNA提取過程最經濟常用的方法為利用有機溶劑將裂解細胞后的蛋白雜質變性沉降，使DNA溶于液相中，再離心分離，整個分離利用的是生物分子的可溶性差異。其他DNA提取方法還有無機法（鹽析法）、吸附法（微型柱）、磁珠法等。

案例：小鼠基因型判定實驗的模板DNA提取

實驗步驟：

1.將1cm尾巴切段置于1.5mL微量離心管中，加入適量裂解液（Lysis buffer）和蛋白酶（Proteinase K）于55~65℃水浴過夜消化。

2.充分消化后的尾巴樣品加入沉淀液（Precipitation buffer）后用旋渦混勻器來使雜質蛋白充分沉淀，雜質沉淀后通過離心操作（如4℃，4000Xg，5min），取出溶有目標DNA的上清液，丟棄雜質沉淀。

3.上清液中加入100%異丙醇，小心顛倒離心管30~40次，便可以將產物DNA沉降。離心操作（4℃，10000Xg或12000rpm，10min）去除上清。

4.用75%乙醇洗滌兩次DNA產物，待乙醇充分揮發后，用水或TE緩沖液（Tris-EDTA buffer）收獲DNA模板產物。

進行后續的PCR擴增實驗前，可以使用Nanodrop儀器進行DNA濃度和純度的測定，提高PCR反應的成功率。在PCR擴增實驗不順利的情況下，也可以進一步對DNA產品的完整度進行檢測。

室中的RNA提取實驗

RNA提取過程與DNA類似，也是通過裂解細胞后通過有機溶劑沉降雜質的方法來分離RNA。但RNA的穩定性比DNA低很多，因此RNA提取對溫度和污染清除的要求更高。實驗操作一般從以下幾個角度來提升成功率：降低RNA水解酶活性、提升RNA穩定性、使RNA與DNA和蛋白分離、僅沉降RNA、有效去除DNA。

案例：總RNA提取

實驗步驟與DNA提取類似，但有機溶劑的使用會有所不同。在首次離心后，混合物會分為三層，RNA溶于上層無色水相，而DNA和蛋白會處于中間層，組織殘渣等雜質處于底層。實驗步驟：1.向提取樣品中加入裂解液（如Trizol），裂解細胞與組織，室溫靜置5-8分鐘。2.充分混勻后離心（4℃，12000rpm，10min），取出上清液。3.向上清液中加入異丙醇沉降RNA，并離心（4℃，12000rpm，10min）棄去上清。4.用75%乙醇洗滌產物兩次，待乙醇揮發后加入RNase-free水溶解產物。

實驗中用到的耐思耗材和儀器