ELISA酶聯免疫吸附劑測定的分類和實驗流程

定義：

酶聯免疫吸附測定（簡寫ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。
常用的ELISA可以分為五大類：直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA、競爭抑制ELISA。其他的ELISA都由這五類組合衍生。
所有的ELISA基本由基礎的幾個步驟組合而成：將抗原或抗體吸附到固相載體上；加入待檢樣品以及后續試劑；溫育；洗滌去掉游離未結合的反應物；加入酶檢測底物；結果的判讀

分類：

1.直接ELISA

將抗原按一定的比例稀釋，包被到固相載體上，加入稀釋好的特異性的酶標抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結果。直接ELISA中只經過了一步信號放大，所以其靈敏度不是很高

2.間接ELISA

間接ELISA與直接ELISA不同的是，與包被好的抗原結合的是非酶標抗體，另外再引入第二種抗體（即二抗）。二抗是經過酶標的，它可以與第一種抗體特異性結合，最后加入底物顯色并判讀結果。在檢測抗體的效價、血清的效價以及單克隆抗體的篩選過程中，間接ELISA都是非常重要的實驗過程。

3.夾心ELISA

3.1直接夾心ELISA

3.1.1雙抗體夾心ELISA           

將第一種抗體（捕獲抗體）包被在固相載體上，封閉后加入待檢抗原，溫育后加入第二種抗體（檢測抗體），捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單抗，也可以是針對同一抗原的一種單抗與一種多抗，但是檢測抗體需要經過酶標。

3.1.2雙抗原夾心ELISA

原理和操作與雙抗體夾心ELISA基本相同，不同的是包被的是抗原，待檢對象是抗體，然后加入酶標抗原，再加底物顯色。雙抗原夾心ELISA利用特異性的抗原代替酶標二抗，所以特異性比間接法更好。另外，由于間接ELISA中使用的二抗一般只能識別IgG，而雙抗原夾心ELISA中任何類似的免疫球蛋白都可以被檢測出，因此，雙抗原夾心ELISA比間接ELISA也更靈敏。

3.2間接夾心ELISA

間接夾心ELISA是基于兩種不同種屬來源的抗體的夾心ELISA，其原理是將一種種屬來源的特異性抗體包被于固相載體上（作為捕獲抗體），封閉，加入待檢抗原，溫育，洗滌后加入另一種種屬來源的特異性抗體（非酶標，作為檢測抗體），最后加入酶標二抗（特異性識別檢測抗體），再加底物顯色。與直接雙抗夾心ELISA相比，其中引入了特異性識別檢測抗體的酶標二抗，相當于整個體系的信號增加了一步放大系統，最終的結果比直接雙抗夾心ELISA更靈敏。

4.競爭ELISA

將特異性抗體吸附于固相載體表面，經洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液；而另一組只加酶標記抗原，再經孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。這種方法所測定的抗原只要有一個結合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。

5.競爭抑制ELISA

預先將抗原包被在固相載體上，實驗時加入稀釋好的待檢抗原（或抗體），然后依次加入特異性的抗體以及此抗體對應的酶標二抗。待檢標本中的抗原（或抗體）就和預制備體系中固相載體上結合的抗原（或抗體）競爭結合特異性的抗體（或固相載體上結合的抗原）。洗掉被競爭的特異性抗體，最后加底物顯色。最終顯色的結果與待檢抗原（或抗體）量呈反比。

實驗材料：

96孔高吸附酶標板[NEST]            10μL/200μL/1000μL吸頭[NEST]
單通道移液槍、多通道移液槍        微量離心管[NEST]
顯色液（A/B液）                  15/50ml離心管[NEST]
洗液（PBST）                      終止液（H2SO4）
BSA蛋白                           稀釋液（PBS）
包被液（CB）                      全波段酶標儀
恒溫箱

實驗流程：

以使用比較廣泛的間接ELISA為例，簡述實驗過程

1.抗原包被：

將對應抗原用CB稀釋至1ug/ml，加入96孔酶標板孔中，每孔100ul，4℃包被過夜，之后進行下一步驟。若實驗時間比較緊張，包被后可放置恒溫箱內，37℃包被3h后即可進行下一步操作。

2.洗板：

將酶標板內的包被液甩干，用洗液（PBST——0.2%的吐溫20 PBS）清洗酶標板2次，并拍干板內液體，使之無余液殘留。

3.封閉：

用PBS充分溶解BSA蛋白制備成封閉液（體積比為5~10%），將封閉液加入酶標板孔中，每孔150ul，恒溫箱37℃封閉1h。若實驗時間安排充裕，可在4℃條件下封閉過夜。

【若抗原內含有偶聯BSA分子，則更換封閉成分，可用羊血清代替】

4.洗板：

將酶標板內的封閉液液甩干，用洗液（PBST）清洗酶標板2次，并拍干板內液體，使之無余液殘留。

【若暫無使用需求，可將包被后的酶標板放置-20℃條件下儲存，需要時解凍使用即可。】

5.一抗：

用PBS稀釋液將待檢樣品（含有對應抗原的抗體）按需求稀釋，再將稀釋后樣本加入包被好的酶標板中，每孔100ul，陰性對照孔加入100ulPBS稀釋液，在恒溫箱中37℃孵育1h。

6.洗板：

將酶標板內的一抗甩干，用洗液（PBST）清洗酶標板3次，并拍干板內液體，使之無余液殘留。

7.二抗：

用PBS稀釋液按照說明，稀釋對應的酶標二抗，將稀釋完成的二抗加入一抗孵育完成的酶標板中，每孔100ul，恒溫箱37℃孵育30min。

8.洗板：

將酶標板內的二抗甩干，用洗液（PBST）清洗酶標板4次，并拍干板內液體，使之無余液殘留。

9.顯色：

將顯色液A/B液等體積混合，配置成顯色液，加入二抗孵育完成的酶標板中，每孔100ul，恒溫箱避光37℃反應5~10min。

【顯色液現配現用，不可提前配置】

10.終止與讀數：

顯色完成后，無須丟棄顯色液，直接加入終止液（H2SO4）終止反應，每孔50ul，隨即轉移至全波段酶標儀450nm單波長度數，或450nm/620nm雙波長讀數，讀書完成后處理數據。

使用到的NEST產品：

96孔高吸附酶標板[NEST]            10μL/200μL/1000μL吸頭[NEST]

微量離心管[NEST]                  15/50ml離心管[NEST]