技術干貨，三血管阻塞模型的制作

急性腦缺血動物模型是研究腦血管病病理機制和防治措施不可缺少的工具。由于臨床上缺血性卒中大多是由于大腦中動脈區域梗死造成，因此人們普通采用血管內線栓法模型，但是由于該模型制作變異性大，而且動物長期存活率低，致使實驗重復性差。

后來經過學者們不斷的摸索優化，發明了開顱后夾閉大腦中動脈(而非電凝)聯合雙側頸總動脈夾閉的大鼠三血管阻塞模型(3-vessel occlusion， 3-VO) ，由于該方法可同時導致大鼠皮質和基底節缺血，被認為是最接近人類卒中的標準動物模型，適用于腦缺血后長期神經功能缺失的康復及介入治療研究中。另外，該模型因其缺血較為迅速、缺血效果好、再灌注血流恢復迅速而更加適用于急性缺血性疾病的研究。

•小鼠：C57BL6J CD-1等小鼠，常用雄性小鼠，體重25-35g

•大鼠：Sprague-Dawley(SD)、Wistar等多種小鼠，常用雄性大鼠，體重250~350g

1.大鼠手術操作步驟

•將大鼠置于手術臺上,取仰臥位,用10m注射器大小的管子放置在大鼠頸后,以加強雙側頸總動脈的顯露。

(1)剃掉頸部和腹側的毛,用75%的乙醇棉球或聚維酮碘進行局部皮膚消毒,頸部中線做一個切口,分離雙側頸總動脈,雙動脈下穿線;分離頸總動脈時小心分離伴行的迷走神經纖維,以免受損傷。

(3)將大鼠體位改為左側臥位。

(4)在大鼠右眼滴加1~2滴人工淚液,閉上眼瞼,避免手術中對眼睛造成損傷;剃掉右側外耳道和右眼外之間的皮毛,使用聚維酮碘局部皮膚消毒,75%乙醇脫碘,在兩個位置連線中點做一切口,長度約2cm。

(5)用止血鉗拉開切口,切斷顳肌,分離肌肉,暴露顴弓。操作工程中要注意保護腮腺和面神經。

(6)用咬骨鉗移除顴弓,用牽張器撐開下頜骨與顴弓,暴露前庭窗;用1.4mm鉆頭的骨鉆在前庭窗的前3mm、下1mm處鉆孔,鉆頭浸在室溫的鹽水中,以免在鉆洞過程中造成皮質熱或物理損傷。在顯微鏡下透過硬腦膜即可看見大腦中動脈,垂直于嗅束向上走行。

(7)用針頭挑破硬腦膜,分離大腦中動脈周圍的蛛網膜,暴露大腦中動脈。用顯微鑷在接近嗅束處將大腦中動脈挑起,用無創微動脈夾夾閉或尼龍線結扎大腦中動脈,夾閉結扎位置在其分支豆紋動脈之前或靠近頸內動脈處。將顳肌和表面皮膚覆蓋回位,用浸透人造腦脊液的紗布覆蓋。

(8)在阻斷大腦中動脈同時,通過尼龍線套扣阻斷雙側頸總動脈的血流(見圖1和圖2)。

(9)缺血1~2h后頸總動脈的動脈瘤夾/縫線和大腦中動脈的縫線都被松開,在顯微鏡下直接觀察3個動脈血流的恢復。

(10)再灌注20min后,用牙科膠泥封閉顱骨手術,再分別縫合切口。允許大鼠麻醉蘇醒后自由進食水。所有大鼠在能通風換氣的(24±0.5)℃孵箱中直到實驗結束。

(a) 在左側眼外眥至外耳道之間做長約2cm的切口;(b)暴露顳肌,純性分離并牽開顳肌；(c)以卵圓窩或者下領神經前方3cm、側方1cm的鱗骨為中心，鉆一直徑為2~4mm的小孔；(d)移去顱骨；(e)暴露大腦中動脈區域；(f)剪開需扎閉區域周圍硬腦膜，用10-0或11-0的帶針縫合線結；大腦中動脈；(g)手術示意圖；(h)結扎雙側頸總動脈。

注:雙側頸總動脈、右側大腦中動脈結扎造成大腦中動脈區域持續、穩定的缺血

2.小鼠手術操作步驟

小鼠的手術操作流程與大鼠基本相同，不同之處是用更小的動靜脈畸形血管夾。

1.注意事項

•麻醉劑對梗死體積的作用

在麻醉和手術過程中對大腦缺血模型都是有影響的。麻醉劑在大腦缺血的病理生理中有重要作用。因此,筆者比較了不同麻醉劑對缺血梗死體積的影響,發現水合氯醛是這模型的理想麻醉劑。

水合氯醛是鎮靜劑，用于治療失眠的短效藥物，可緩解焦慮，在手術前誘導睡眠或治療乙醇戒斷癥狀，也可用于術后緩解疼痛。用水合氯醛比用其他的麻醉藥(如氯胺酮、賽拉嗪、乙醚和異氟醚)模型的梗死體積和結扎時間有更好的相關性。水合氯醛的另一優點在于不是管制藥品,在購買和存放時減少了很多限制要求。

•血糖對梗死體積的影響

在臨床研究中發現，血糖水平是缺血腦損傷一個主要的決定因素。三血管MCAO模型也證實血糖水平對缺血結果有重要影響。高血糖導致梗死體積明顯增大，并且高血糖是缺血期間最有害的因素，反之低血糖則能減少梗死體積。在治療窗內使血糖恢復正常能有效減少梗死體積。

然而，血糖對腦缺血作用的分子機制還不清楚。缺血前禁食24h能減少缺血24h后的腦損傷,這一作用持續至再灌注后28d。盡管COX-1基因治療能在缺血24h后減少大腦梗死體積，但是在再灌注后的28d未見其持續的保護作用。這些結果均表明血糖對缺血腦損傷有重要作用,且是評價缺血的遠期預后的一個重要因素。

•腦水腫對梗死體積的影響

在局灶性腦缺血的動物模型中，通過特殊組織染色觀察每一個腦片的梗死部位，通常通過測量這些梗死面積來確定梗死體積。

形態學測定分析梗死體積是一個客觀并且定量的評估缺血腦損傷程度的方法，同時這種方法在臨床前的研究中常被用于判斷神經保護劑的有效性。然而，腫脹的缺血組織可能導致測得的梗死區域增大，因此高估了實際的梗死體積。把腦水腫包括在梗死體積內計算可使實際的梗死體積增加多達22%。

因此，因腦水腫引起的梗死體積失真可能使得干預治療的有效與否難以解釋。可通過測量皮質的水含量和MRI確定在這一模型缺血損傷后的1~3d腦水腫的嚴重程度來減少因腦水腫導致的誤差，Swanson等提出了一種基于正常存活的灰質體積來計算梗死體積的方法，這一方法進一步被林等證實。

顯然，以前直接測量梗死體積的方法在缺血后前3d腦水腫進展期間所測得的數據要高于實際梗死體積，這一誤差能通過基于對非梗死皮質體積的間接測量得以減少。

•性別對梗死體積的影響

流行病學研究發現，女性(直至絕經后,即55歲后)心血管病的患病率低于男性，卒中的發病率也是如此。有短暫性缺血發作或小卒中的女性發病率低于男性。動物研究也表明性別不同，卒中的結果不同。在三血管MCAO模型中，雄性比雌性大鼠的梗死體積更大。當在三血管MCAO模型中混有雄性和雌性大鼠時，應該考慮性別的影響。

•溫度對梗死體積的影響

研究發現，即使是輕微的大腦溫度降低，也能對缺血損傷的大腦起到保護作用。Connolly等的研究顯示，MCAO模型后，小鼠無法自我調節體溫，在保護期出現嚴重的低溫，而這種體溫變化對MCAO模型后病理結果有顯著的影響，是損傷了下丘腦體溫調節中樞所致。

2.常見問題及解決方法

•梗死面積太小

在該模型中，選擇截斷大腦中動脈主干血流的部分十分重要。實踐經驗認為只有在鼻裂間隙正上段部位的血流阻斷才能得到相對合適的梗死范圍。

•損傷腦組織或出血

在手術阻斷大腦中動脈主干時，電凝或結扎該血管都很容易造成鄰近此血管的腦組織損傷，如果電凝不到位或結扎過于用力，或手術操作粗暴，都極易損傷大腦中動脈主干，從而導致大出血，使手術失敗。

*以上內容部分源自《實驗卒中模型方法學》

書號：ISBN 978-7-313-21776-9

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