人肺類器官在COVID-19新冠藥物篩選中的運用
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2020年5月5日，由美國康奈爾醫院的Yuling Han團隊在生物學預印本bioRxiv中發表的題為《Identification of Candidate COVID-19 Therapeutics using hPSC-derived Lung Organoids》的文章，全球首次報道了用肺類器官模型研究COVID-19及其治療藥物的篩選。 |
| Part 1 誘導hPSC分化為肺類器官，肺類器官組織對SARS-CoV-2偽病毒感染敏感，且體內外研究結果一致 |
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研究人員們使用多種細胞因子及小分子組合體外定向誘導hPSC分化，使之分化為定型內胚層(DE)，再分化為前腸內胚層(AFE)（前腸內胚層含肺部祖細胞(LPs) )，最終誘導其分化為肺類器官。通過分析單細胞轉錄組特征，鑒定肺類器官細胞類型，如II型肺泡細胞(AT2細胞, SP-B+SP-D+ABCA3+)、I型肺泡細胞(AT1細胞, PDPN+APQ5+)、基質細胞、增殖細胞、神經內分泌細胞(ASCL1+CALCA+)以及氣道上皮細胞等(圖1a)。
 圖1d ACE2和TMPRSS2在AT2細胞的表達(SFTPB、SFPTD和 ABCA3為AT2細胞的表面標志物)
研究人員使用表達SARS-CoV-2刺突糖蛋白的水皰性口炎病毒(VSV) - SARS-CoV-2偽病毒感染肺類器官。熒光素酶(LUC)活性檢測結果顯示SARS-CoV-2偽病毒能輕松入侵人hPSC誘導的肺類器官(圖1f)。  圖1f ARS-CoV-2偽病毒感染肺類器官熒光素酶(LUC)活性檢測結果 為了研究人類肺器官的體內模型，研究人員將體外培養了25天的肺祖細胞(LPs)注射到免疫缺陷的NSG小鼠皮下，待其生長分化4個月后(圖1g)，成為具有肺泡組織樣結構(圖1h)的異種移植體。免疫熒光染色結果顯示，在異種移植體中存在大量表達ACE2的SP-B+AT2細胞(圖1i)。  圖1g-i 小鼠體內LPs誘導形成肺泡組織及組織內AT2細胞鑒定
研究人員將SARS-CoV-2偽病毒注射入移植體，24小時后檢測到SP-B+AT2細胞熒光素酶(LUC)的表達顯著高于對照組(圖1j)。LPs誘導形成的肺異種移植體對SARS-CoV-2病毒感染同樣敏感。  圖1j SARS-CoV-2偽病毒感染肺異種移植體 Part 2 研究人員將肺類器官與SARS-CoV-2共培養，考察SARS-CoV-2感染肺類器后病理變化，感染24小時后，肺類器官中SARS-CoV-2 DNA及SARS-S蛋白含量顯著升高(圖2a,b)，RNA序列檢測結果證實了SARS-CoV-2的強勁復制。研究人員還發現肺類器官中趨化因子及細胞因子表達顯著上調，但并未檢測到I型和III型IFNs。
 圖2 a,b 肺類器官中SARS-CoV-2 DNA及SARS-S蛋白含量檢測結果基因集合富集分析(GSEA)結果顯示，感染的肺類器官多條信號通路上調，如TNF信號通路、IL-17信號通路、趨化因子信號通路等，其中IL-17信號通路的上調與COVID-19患者肺組織的檢測結果相一致(圖2f, h)。以上研究結果均表明人肺類器官模型可以作為研究SARS-CoV-2感染以及致病機制的工具。
 圖2f hPSC誘導的肺類器官與對照組相比不同信號通路基因過表達分析  圖2h COVID-19患者與健康者相比不同信號通路基因過表達分析 Part 3
使用hPSC來源的肺類器官篩選治療COVID-19的候選藥物 為了明確能夠阻斷SARS-CoV-2偽病毒感染的候選藥物，研究人員將hPSC來源的肺類器官轉移至384孔板，培養6小時使其成團。選擇FDA批準的藥物以10 μM的濃度處理2小時后，將SARS-CoV-2偽病毒與肺類器官共培養，24小時后對類器官進行熒光素酶活性分析。選擇Z值<-2孔使用的藥物為候選藥物。對不同濃度的候選藥物進行藥物效力和細胞毒性分析(圖3e, f, g)。imatinib、mycophenolic acid(MPA)和quinacrine dihydrochloride(QNHC)三種藥物被證實不依賴于細胞毒性，以劑量依賴的方式阻斷SARS-CoV-2偽病毒感染。
 圖2e, f, g Imatinib, MPA, QNHC效力及細胞毒性檢測曲線 免疫熒光染色結果顯示，使用10 μM imatinib、3μM MPA或4.5 μM QNHC處理肺類器官，可顯著降低SARS-CoV-2偽病毒的感染率(圖3h)。  圖3h SARS-CoV-2偽病毒感染imatinib, MPA, QNHC處理過的肺類器官 為了評估藥物在體內的抗病毒感染活性，研究人員將LPs注射到NSG小鼠皮下，待其4個月生長成熟后，將imatinib、MPA和QNHC分別注射入異種移植體內，三小時后使用SARS-CoV-2偽病毒感染該移植體(圖3i)。24小時的免疫熒光檢測結果顯示，三種藥物均能阻止SARS-CoV-2偽病毒對AT2細胞的感染(圖3j)。
 圖3i LPs誘導形成肺泡組織的小鼠體內給藥方案
 圖3j 體內給藥后，SARS-CoV-2偽病毒感染肺異種移植體 類器官因其在結構組織及功能上與體內組織器官高度相似，可用于體外模擬體內生理病理變化過程，因此選擇人肺類器官做為COVID-19藥物篩選的工具將會更加便捷。目前，已有三個使用imatinib治療COVID-19患者的臨床試驗(NCT04346147, NCT04357613，NCT04356495)注冊。使用類器官進行藥物篩選的研究可以更好地為臨床試驗提供數據支持。
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