人肺臟類器官培養在探究新冠病毒感染肺的機制的應用
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| 引言 眾所周知，新冠病毒是會引起肺部損傷的。為助力您探究其感染機制，PeproTech在此為您提供一份全面的人肺臟類器官培養方案。 肺類器官由ESCs/iPSC分化而來，hESCs體外肺分化實際上是通過加入多種細胞因子和小分子化合物模擬體內肺發育各階段的過程，hESCs體外肺分化主要經歷以下幾個階段：
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| ▶▶ 實驗材料◀◀ |
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1. Matrigel人胚胎干細胞培養用基質膠,于冰上分裝后保存于-80℃。(Corning,Cat#354277) 2.Advanced DMEM/F12培養基。(Thermo, Cat#12634010) 3. Matrigel類器官培養用基質膠，于冰上分裝后保存于-80℃(Corning,Cat#356231) 4.Knock Out Serum Replacement, 分裝后保存于-20℃。(Thermo,Cat#A3181502) 5.B-27 trademark Supplement(50X), 分裝后保存于-20℃(Thermo,Cat#17504044) 6.N-2 Supplement(100X),分裝后保存于-20℃。(Thermo,Cat#17502001) 7.HyClone-defined FBS ，分裝后保存于-20℃。(Thermo Fisher Scientific,Cat#10437010) 8.mTeSR™1(Stemcell Technologies, Cat#85850) 9.Activin A配制為100μg/ml, 保存于-80℃，使用終濃度為100ng/ml。(PeproTech,Cat#120-14) 10.Noggin配制為200μg/ml,保存于-80℃，使用終濃度為200ng/ml。(PeproTech,Cat#120-10C) 11.FGF4配制為500μg/ml,保存于-80℃，使用終濃度為500ng/ml。(PeproTech,Cat#100-31) 12.FGF10配制為500μg/ml,保存于-80℃,使用終濃度為500ng/ml。(PeproTech,Cat#100-26) 13.Y-27632配制為10mM, 保存于-80℃，使用終濃度為10μM。(BioGems, Cat#1293823) 14.SB431542配制為10mM, 保存于-80℃，使用終濃度為10μM。(BioGems, Cat#3014193) 15.CHIR99021配制為2mM, 保存于-80℃，使用終濃度為2μM。(BioGems, Cat#2520691) 16.SAG配制為1mM, 保存于-80℃，使用終濃度為1μM。(BioGems, Cat#9128694) 17.Accutase消化液(Thermo,Cat#A1110501) |
| ▶▶ ESCs/iPSC培養傳代步驟◀◀ |
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01/ hESCs的復蘇
預先將Matrigel(Cat#354277)從-80℃取出，置于冰上融化，隨后用預冷的DMEM/F1培養基稀釋100倍，取1ml加入六孔板的一個孔，晃勻至鋪滿孔板底部。六孔板置于37℃培養箱中至少30min，備用。mTesR1人胚胎干細胞培養基提前從4℃冰箱取出，室溫放置約10min。從液氮凍存盒中取出H9細胞(hESC細胞系)，快速移入37℃水浴鍋中融化，輕柔晃動至凍存管還剩小塊冰即取出，小心將細胞轉入15ml離心管，加入５ml mTesR1培養基輕輕混勻細胞，1000rmp/5min離心，小心棄去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培養基重懸細胞，細胞接種于基質膠包被的培養板，置于37℃培養箱中培養。次日加入DMEM/F12培養基輕柔洗一次，更換新鮮不含Y-27632的mTesR1培養基，置于37℃培養箱中繼續培養。 02/ hESCs的培養 每天更換新鮮mTesR1培養基前應觀察細胞狀態，若發現大量死細胞漂浮于培養基(剛復蘇的細胞狀態較差)，則棄去培養基，加入預熱的DMEM/F12培養基輕柔洗細胞一次，棄去DMEM/F12培養基，加入新鮮mTesR1培養基，置于37℃培養箱中繼續培養。 03/ hESCs的傳代 細胞約3~5天生長至80%匯合度，狀態良好的hESCs克隆明顯，邊緣光滑。細胞傳代時根據實驗需要提前用Matrigel包被培養板，細胞用DMEM/F12培養基洗2次，在六孔板每孔中加入1ml Accutase消化液，置于37℃培養箱中消化3~5min，傳代比例為1:5~1:10。每隔2min在倒置顯微鏡下觀察細胞，待克隆邊緣發亮即小心棄去消化液，加入2ml含10μM的Y-27632的mTesR1培養基輕柔吹打細胞數次，收集細胞于15ml離心管，1000rmp/5min離心，小心棄去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培養基重懸細胞，轉入基質膠包被的培養板，置于37℃培養箱中繼續培養。過夜后更換新鮮的不含Y-27632的mTesR1培養基，置于37℃培養箱中繼續培養，每天換液。 04/ hESCs的凍存 凍存液為含5~10％二甲基亞砜(DMSO)的血清替代品(KOSR)，置于４°Ｃ備用。按照前述細胞傳代的方法收集細胞，用細胞凍存液輕柔重懸細胞，轉入凍存管，做好標記，置于凍存盒，-80℃過夜后轉入液氮中長期保存。 |
| ▶▶ 肺類器官的培養分化◀◀ |
| 01/ 取對數生長的hESCs肺類器官分化，hESCs(生長至約90％匯合)用預熱RPMI1640基礎培養基輕柔洗２次，加入含100ng/ml的ActivinA和2μM的CHIR99021的定型內胚層(DE)階段誘導培養基(誘導第二天培養基內需要添加0.2%FBS, 誘導第三、四天培養基內需要添加2%FBS)，每天換液，共4天。 02/ 第４天，細胞用Advanced DMEM/F12培養基輕柔洗2次，在DMEM/F12培養基種加入1xB27, 1xN-2以及含200ng/ml的Noggin，500ng/ml的FGF4，2μM的CHIR99021，1μM的SAG和10μM的SB431542的前部前腸內胚層(AFE)階段誘導培養基，每天換液，共5天。 03/ 第9天，待細胞分化成前腸球體后，細胞用Advanced DMEM/F12培養基輕柔洗２次，加入適量Accutase消化液消化3~5min，收集細胞，1000rmp/5min離心,棄上清，加入適量預冷Matrigel(Cat#356231)，吹打混勻，注意不要產生氣泡，加入50ul種于24孔板內，37℃培養箱放置約30min，待Matrigel固化后加入肺類器官培養基(含1％FBS的 Advanced DMEM/F12培養基，1xB27, 1xN-2，500ng/ml FGF10)同時需要補加10μM的Y-27632。過夜后更換新鮮的含肺類器官培養基。細胞每3~5天換液一次，每５~８天傳代一次，傳代時需要加入含10μM的Y-27632肺類器官培養基。大約培養50天肺類器官可以成熟。 |
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| 表1：肺類器官誘導培養用培養基配制方法 |
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| 肺類器官培養步驟 |
| 注：AdvancedDMEM/F12培養基中若含有HEPES和L-glutamine，則不需要額外添加。 |
| ▶▶ 誘導培養用細胞因子和小分子◀◀ |
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