人胰高血糖素樣肽1.7-36 ELISA試劑盒使用說明

人胰高血糖素樣肽1.7-36（GLP-1.7-36）酶聯免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中胰高血糖素樣肽1.7-36（GLP-1.7-36）的含量。
 
實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人胰高血糖素樣肽1.7-36（GLP-1.7-36）水平。用純化的人胰高血糖素樣肽1.7-36（GLP-1.7-36）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入人胰高血糖素樣肽1.7-36（GLP-1.7-36），再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰高血糖素樣肽1.7-36（GLP-1.7-36）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人胰高血糖素樣肽1.7-36（GLP-1.7-36）含量。
 
試劑盒組成：

試劑盒組成	48孔配置	96孔配置	保存
說明書	1份	1份
封板膜	2片	2片
密封袋	1個	1個
酶標包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
標準品	0.3ml×6管	0.3ml×6管	2-8℃保存
酶標試劑	5 ml×1瓶	10 ml×1瓶	2-8℃保存
樣品稀釋液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
20×濃縮洗滌液	15ml×1瓶	25ml×1瓶	2-8℃保存

注：標準品濃度依次為：8、4、2、1、0.5、0 pmol/mL.
 
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
 
操作步驟

• 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。
• 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
• 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。
• 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
• 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
• 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
• 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. 
• 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
• 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

注意事項：

• 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。
• 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
• 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
• 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
• 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
• 底物請避光保存。
• 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
• 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
• 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
  以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，    在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。  
（此圖僅供參考）
 
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。
 
檢測范圍：                                              
0.25 pmol/mL - 8 pmol/mL
 
靈敏度：                                              
最低檢測濃度小于0.1 pmol/mL
 
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存： 2-8℃。
2．有效期： 6個月
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