NADP-蘋果酸酶Malic enzyme ，NADP-ME試劑盒說明書

NADP-蘋果酸酶（Malic enzyme ，NADP-ME）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48 樣
正式測定前務(wù)必取2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果酸氧化
脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME 活性與
生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物ME 活性測定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一
性和對底物特異性的不同，可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測定原理：
NADP-ME 催化NADP+還原成NADPH，在340nm 下測定NADPH 增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。；
試劑一：液體60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存； 臨用前加入50mL 試劑一充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20
度保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入6mL 蒸餾水充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20 度
保存，禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液
體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰
浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30 次）；14000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL 提取液），
進(jìn)行冰浴勻漿。14000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、 分光光度計預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、在1mL 石英比色皿中加入50μL 樣本和850μL 試劑二，混勻，30℃孵育5min，加入100μL 試劑三，
混勻后立即記錄340nm 處初始吸光值A(chǔ)1 和 1min 后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。
NADP-ME 活性計算：
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g 組織每分鐘生成1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =3215×ΔA÷W