Mass Frontier碎片離子檢索功能（FISh）在士的寧代謝物鑒定中的應用

周哲 江崢

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

關鍵詞： 碎片離子檢索，FISh，代謝物，LTQ Orbitrap

 

 

馬錢子為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-Vomical L.的干燥成熟種子, 其主要活性成分是生物堿，具有通經絡、消腫痛、止痛的功效, 是中醫臨床常用藥物。其中主要有效成分士的寧（strychnine）又名番木鱉堿，屬于中樞神經興奮劑，能選擇性興奮脊髓，增強骨骼肌的緊張度，臨床用于偏癱、癱瘓及因注射鏈霉素引起的骨骼肌松弛、弱視癥等和巴比妥類中毒等。但這類成分有劇毒, 作為藥用必須嚴格控制其用量。此外，添加士的寧的飼料誘餌可用來消滅老鼠等嚙齒類有害動物。然而這些動物體內殘留士的寧會通過食物鏈傳遞, 對整個生態圈造成影響。因此有必要建立快速、靈敏、準確的方法檢測該類藥物, 為臨床用藥、環保、司法等部門提供可靠的分析手段和數據。

 

本文采用高效液相色譜-離子阱靜電場軌道阱高分辨質譜聯用技術對士的寧及其代謝產物進行了全面的分析，利用線性離子阱技術對目標化合物進行MSn多級碎裂，并通過Orbitrap靜電場軌道阱技術獲得一級和多級質譜的高分辨質譜信息。Mass Frontier 7.0結構解析軟件具有豐富的裂解機理數據庫能夠進行準確的碎片歸屬，其獨有的碎片離子檢索（Fragment Ion Search, FISh）功能將母藥和代謝物共有碎片及代謝途徑有機結合到一起，可以檢獲代謝物的全面信息。

 

 

2.1 液相色譜條件：

儀器：Accela HPLC system液相色譜儀

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil Gold C18 （100×2.1 mm, 1.9 μm）流動相：A為水相：0.05%甲酸 2 mM甲酸銨水溶液，B為有機相：0.05%甲酸 2 mM甲酸銨乙腈溶液

 

梯度條件：

 

流速0.2 mL/min，進樣量：5 μL，柱溫為30℃

 

儀器：Thermo LTQ Orbitrap XL

質譜離子源參數：ESI Spray voltage：+4.0 KV；Sheath Gas Pressure：35 arb；Aux Gas Pressure： 8 arb；Capillary Temp：275℃； Scan mode：Full MS with data-dependent MSn；CID（collision energy 35%，activation time 30 ms）；Scan range： m/z 200~700。

 

按5 mg/kg劑量口服喂食雄性大鼠士的寧，6小時后取大鼠尿樣，SPE固相萃取純化富集，取適量稀釋后進樣分析。

 

 

采用Mass Frontier的聯合組分檢測（Joint Components Detection）算法，對質譜數據中的代表性組分進行查找。基于所有離子輪廓圖最大值的統計分析，通過提取各個質譜峰豐度輪廓圖，可創建出士的寧母藥及其他可能代謝物的“純凈”質譜樹，并生成相應的峰形（圖1）。

 

 

圖1. 聯合組分檢測（Joint Components Detection）算法查找代表性組分

 

在獲得士的寧“純凈”質譜樹后，使用Mass Frontier碎裂數據庫（Fragmentation Library），可快速的對士的寧碎片結構進行歸屬，該數據庫幾乎涵蓋了所有已發表的文獻，所以在快速解析碎片的同時，可獲得完整的碎片裂解途徑，并可方便的調用查看所引用的文獻情況，保證了碎片解析的準確性（圖2）。

 

 

圖2. 破裂數據庫（Fragmentation Library）歸屬士的寧碎片及裂解途徑

 

LTQ Orbitrap XL的線性離子阱相比傳統三維離子阱具有更高的離子容量，故具有優異的多級質譜能力，能夠高效的捕獲前級離子進行碎裂，并獲得高靈敏度的碎片離子信息，在對士的寧母離子的采集過程中，獲得了其四級有效質譜信息（MS4）。通過多級質譜解析，總結出士的寧完整裂解機理，為未知代謝物檢索帶來有價值的信息（圖3）。

 

 

圖3. 士的寧MS4離子樹及完整裂解機理

 

碎片離子檢索功能利用母藥和代謝物的結構相關性，采用母藥的特征質譜碎片，結合代謝途徑，完成對未知代謝物的檢索。利用該功能，在完成了士的寧母藥的質譜裂解規律后，將特征碎片導入FISh模塊中，并選擇可能的代謝途徑，結合代表性組分查找，檢索士的寧未知代謝物的全面信息（圖4）。

 

 

圖4.碎片離子檢索士的寧未知代謝物工作流程

 

通過碎片離子檢索獲得準確全面的未知代謝物信息，包含未知代謝物色譜信息、一級多級質譜數據、未知代謝物代謝途徑等信息，同時FISh 解釋功能還可以通過母藥及代謝物多級質譜信息之間的比對，進一步對代謝位點進行推測（圖5）。

 

 

圖5.士的寧未知代謝物檢索鑒定結果

 

以RT 11.5 min的未知代謝物為例，通過FISh計算，獲知該未知代謝物為羥基化代謝產物，通過FISh解釋功能比對264.1、280.0、323.1、334.2、238.0 m/z等特征碎片，推測出該代謝物為16-Hydroxystrychnine（圖6）。

 

 

圖6.士的寧代謝物16-Hydroxystrychnine

 

使用相同處理方法，共檢測到士的寧26個代謝產物，其中一相代謝產物22個，二相代謝產物4個，見表1。

 

表1. 士的寧代謝產物鑒定結果

 

 

4.1 Thermo LTQ Orbitrap XL質譜儀將線性離子阱與高分辨靜電場軌道阱Orbitrap 檢測技術相結合，提供優異的性能和出色的多功能性。線性離子阱更高的離子容量能夠高效的捕獲前級離子進行多級碎裂，獲得高質量的多級質譜圖，本實驗通過線性離子阱逐級裂解剖析了士的寧完整裂解機理。Orbitrap技術具備高分辨高質量精度（HR/AM）的能力，本實驗中士的寧代謝產物質量偏差<3 ppm，能夠有效的排除干擾，獲得代謝物準確的元素組成。

 

4.2 Mass Frontier為Thermo專業的結構解析軟件，利用其豐富的碎裂數據庫（Fragmentation Library），可快速的對士的寧多級碎片結構進行了準確推測和歸屬，在快速解析碎片的同時，可獲得完整的碎片裂解途徑，并可方便的調用查看所引用的文獻情況，保證了碎片解析的準確性。母藥和代謝物存在結構相關性，質譜多級碎裂后可能生成共有碎片，碎片離子檢索（FISh）功能將這種相關性與可能的代謝途徑有機的結合起來，從繁雜的基質樣品質譜信號中準確的篩選到未知代謝物信息，通過比對母藥和代謝物多級質譜信息， FISh解釋功能更可進一步對代謝位點進行推測。