DNA & RNA 寡聚核苷酸的準確分子質量測定

聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

LTQ-Orbitrap Elite；核酸藥物；分子質量測定

 

隨著人們對核酸結構和功能的深入了解,特異性結合或者裂解致病基因的核酸藥物也逐漸成為了藥物研究的新熱點, 核酸藥物的作用效率高、應用范圍廣，可以對傳統藥物進行補充，并且在前期的臨床診斷中也可以起到重要的指示作用。核酸藥物主要是指各種具有不同功能的寡聚核糖核苷酸（RNA）或者寡聚脫氧核糖核甘酸（DNA），主要作用于基因水平，在信息流傳遞的上游階段起作用，效率比較高，且通過結合或者裂解特異性的致病基因，而對其它基因沒有任何影響。在信息流的傳遞過程中，信號逐級放大，一個基因可以轉錄出多個 mRNA，一個 mRNA 又可以翻譯出多個蛋白質，所以與作用于信息流最終產物-蛋白質相比，核酸藥物具有廣泛的應用前景。目前的核酸藥物可以與一些轉錄因子、凝血酶、人類免疫缺陷病毒、雙鏈 DNA 的特殊部位等結合，從而抑制 DNA 的復制或者蛋白、受體等的結合，從而干擾和阻止病毒或者錯誤基因和蛋白的表達和放大，因此在基因藥物的研發和生產過程中，建立和發展一種更有效、靈敏、快速和精確的寡聚核苷酸的結構和序列分析方法，一直都是生物化學家、醫藥工作者和儀器分析公司的研究課題之一。

 

生物質譜的技術為寡聚核苷酸的分子質量和序列分析提供了新的途徑。之前，基質輔助激光解吸電離飛行質譜（MALDI-TOF）主要用于分子質量比較小的寡聚核苷酸分析，受儀器的靈敏度，分辨率，堿金屬離子加合峰的影響，測試的精確度和可靠性都存在一定問題。另外，基于常規的電噴霧離子阱（Ion Trap）質譜的檢測，同樣受限于分辨率與質量精度，也無法滿足高精度、高分辨、高靈敏的寡聚核苷酸的檢測分析。

 

LTQ-Orbitrap Elite 組合式質譜儀結合了最新的雙壓線性離子阱質譜儀和新型高場 OrbitrapTM 質量分析器，可以提供高達240,000 的分辨率（FWHM）、高靈敏度、快速的掃描速度和更大的動態范圍，并且可以在同一臺質譜上可以同時實現低分辨和高分辨掃描，滿足客戶的不同需求。該系統可以為寡聚核苷酸的分子質量測定提供準確、快速、可靠的分析測試。

 

質譜儀器：LTQ-Orbitrap Elite（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Accela 液相色譜系統（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：BioBasic 色譜柱（C8, 2.1×50 mm，5 μm，300 Å）（賽默飛世爾科技，美國）；

試劑：乙酸銨、二次去離子水，色譜級甲醇。

 

色譜分析條件：具體見表 1；

質譜分析條件：具體見表 2；

 

表 1. 寡聚核苷酸分子質量測定的色譜分析條件

 

表2寡聚核苷酸分子質量測定的質譜分析條件

 

采用 ProMass 軟件對原始質譜圖進行去卷積處理，得到完整的寡聚核苷酸的分子質量信息。

 

3.1 低分辨 LTQ 質量檢測器測定寡聚核苷酸的分子質量

3.1.1 原始色譜質譜圖

 

 

采用 5 min 的梯度分析，離子阱采集數據，寡聚核酸主要在 3.53 min 出峰。

 

3.1.2 原始質譜圖

 

 

將上圖中 3.53 min 附件的寡聚核苷酸譜圖信號平均后，得到該寡聚核苷酸的平均質譜圖，由于 LTQ 的分辨率有限，無法將電荷直接分辨出來，因此需要通過軟件進行去卷積處理，從而得到該寡聚核苷酸的分子質量。

 

3.1.3 去卷積之后的質譜結果

 

通過 ProMass 軟件去卷積之后的平均分子質量為 9247.3，與理論的平均分子質量完全一致，并且 ProMass 軟件對原始質譜圖中質譜峰的電荷進行了歸屬，如下所示，質荷比為 1540.2 的質譜峰對應的電荷為 –6 價，質荷比為 1848.5 的質譜峰對應的電荷為–5 價。

 

3.2.1 原始色譜質譜圖

 

 

與低分辨的實驗相比，在保持上樣量和色譜條件不變的前提下，僅僅改變質譜采集的分辨率，可以看到寡聚核苷酸的色譜保留時間不變，基本在 3.52 min 出峰，不過隨著質譜檢測器分辨率的提高，原始質譜圖發生了顯著的變化，如下所示，當使用線性離子阱 LTQ 作為質量檢測器時，只檢測到一個大包峰，無法分辨電荷；當使用 Orbitrap 作為質量檢測器，分辨率 R 設置為 15000 時，同樣也只檢測到一個大包峰，電荷仍然無法分辨；當使用 Orbitrap 作為質量檢測器，分辨率 R 設置為 30,000 時，可以觀察到一些同位素峰，電荷可以實現分辨；當使用 Orbitrap 作為質量檢測器，分辨率 R 設置為 60,000 時，可以觀察到稍微好一些的同位素峰，但無法完全分離，電荷同樣可以實現分辨；當使用 Orbitrap 作為質量檢測器，分辨率 R 設置為 120,000 時，同位素峰可以實現完全分離，電荷同樣也可以實現分辨；當使用 Orbitrap 作為質量檢測器，分辨率 R 設置為 240,000 時，同位素峰可以實現完全分離，并且峰形更加尖銳，電荷同樣也可以實現分辨，由此我們可以準確的計算得到寡聚核苷酸的單同位素質量和平均質量，最后的實驗結果與理論預測的分子質量保持完全一致。

 

 

同樣，我們對幾個不同分子質量的寡聚核苷酸進行了不同分辨率的質譜測試，結果如下所示：

 

 

從上面的質譜圖中，可以看到，隨著質譜分辨率的提高，寡聚核苷酸的同位素峰可以實現完全分離，并且峰寬更窄，電荷也可以實現完全分辨，并且無需軟件輔助，就可以直接計算得到寡聚核苷酸的單同位素質量和平均分子質量，使得寡聚核苷酸的分析測試更加快速和直接。

 

本文通過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜建立了寡聚核酸藥物分子質量分析的色譜質譜在線方法，可以在核酸藥物的研發分析和實時生產檢測中，更加有效、靈敏、快速和精確的測定寡聚核苷酸的分子質量。實驗結果表明 LTQ-Orbitrap Elite 組合式質譜儀，憑借其超高的分辨率，超快的掃描速度，超高的質量精度、超低的靈敏度和超大的動態范圍，極大地完善和推動了基因藥物的鑒定分析。