高效液相色譜串聯質譜法測定血漿中的替加環素
高效液相色譜串聯質譜法測定血漿中的替加環素
周 亮
賽默飛世爾科技（中國）有限公司
1.引言
替加環素（Tigecycline）又名9- 叔丁基甘氨酰胺基米諾環素、丁甘米諾環素，是首個被批準用于臨床的靜脈內給藥的甘氨酰四環素類抗生素，具有超廣譜的抗菌活性，包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的好氧菌及厭氧菌等臨床分離的重要致病菌。替加環素的作用機制與四環素類抗生素相似，都是通過與細菌30S 核糖體結合，阻止轉移RNA的進入，使得氨基酸無法結合成肽鏈，最終起到阻斷細菌蛋白質合成，限制細菌生長的作用。替加環素能夠克服或限制細菌的外排泵和核糖體保護兩種耐藥機制的作用，不易產生耐藥性，其廣泛的組織分布和較長的清除半衰期的藥動學性質令人樂觀；同時對于腎功能紊亂及需進行血液透析的患者，不必進行劑量和時間上的調整。2005 年6 月美國FDA 批準用于成人復雜皮膚及軟組織感染和成人復雜的腹內感染，但在國內尚處于臨床研究、申報生產階段。
本實驗建立了測定血漿中替加環素的LCMSMS 方法，采用適當的樣品前處理方法，血漿中的雜質不干擾樣品的測定，具有靈敏度高，重現性較好等特點。
2．實驗部分
2.1 儀器與試劑：
TSQ Vantage 三重四極桿串聯質譜儀（賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific 公司），配置有電噴霧電離源（ESI）；Dionex Ultimate 3000 RSLC 超高壓液相色譜。
標準品：替加環素和內標鹽酸四環素純度均大于98％，信息見表1。用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL 標準儲備液，再根據需要稀釋成適當濃度的混合標準工作液。其他試劑均為HPLC 色譜純。
表1. 待測化合物信息
2.2 儀器方法：
2.2.1 液相條件：
色譜柱：Hypersil GOLD C18，100mm×2.1mm；
梯度洗脫程序見表2，進樣量5μL。
表2. 液相色譜梯度條件
|
時間/min |
水(0.2%甲酸+5mM甲酸銨) |
乙腈 |
流速/μL/min |
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0.00 |
95 |
5 |
400 |
|
3.00 |
20 |
80 |
400 |
|
3.50 |
20 |
80 |
400 |
|
3.60 |
95 |
5 |
400 |
|
5.00 |
95 |
5 |
400 |
2.2.2 質譜條件：
電噴霧電離源（ESI），正離子模式；選擇反應監控（SRM）掃描模式，噴霧電壓：3000V；氣化器溫度320℃，離子傳輸管溫度：350℃；氮氣作為鞘氣和輔助氣，其中鞘氣為35arb，輔助氣為10arb，氬氣用作碰撞氣, 碰撞壓力為1.5mTorr；選擇反應監測（SRM），離子對信息見表3。
表3. SRM 模式中的離子對信息
其中，替加環素選取m/z 513.2，四環素選取m/z 410.2 的離子作為定量離子。
2.3 血漿樣品處理方法：
向0.2mL 血漿中加入10μL 內標液（100ng/mL 四環素溶液），加入100μL20% 三氯乙酸（TCA） 沉淀蛋白， 渦旋混合1min，離心10min（13000r/min），取5μL 上清液進樣分析。
3. 方法學驗證結果分析
3.1 特異性：
本實驗所用的檢測條件下，替加環素在1.98min 左右出峰，內標四環素在2.49min 左右出峰，峰形良好，無雜質峰干擾測定，基線平穩（見圖1）。本方法具有較高的特異性，能準確測定血漿中替加環素的濃度，靈敏度較高。
圖1. 血漿中替加環素及內標四環素的色譜圖
（A-F）：6個不同來源的空白血漿的色譜圖；
（G）：空白血漿加入已知濃度替加環素和四環素的色譜圖
3.2 最低檢出限（LLOD）
取10μL 替加環素標準溶液加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度為100ppt 的標準含藥血漿，按“血漿樣品處理”項下操作，記錄色譜圖，得到替加環素血漿基質前加標的最低檢出限，S/N=6，結果圖2。
圖2. 替加環素LLOD 的色譜圖
3.3標準曲線和定量范圍
將1mg/mL 替加環素溶液逐級稀釋成一系列濃度，分別取10μL 加入到空白血漿中，配成0.2mL 的濃度分別為5,10,50,100,500,1000,2000ppb 的標準含藥血漿，按“血漿樣品處理”項下操作，記錄各標準點和內標的峰面積，以濃度為橫坐標，分析物與內標的峰面積比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸計算，求得直線回歸方程即為標準曲線，平行操作3 次，結果見表4，圖3。
表4. 替加環素標準曲線（n=3）
圖3. 替加環素標準曲線圖
3.4 精密度和準確度
分別取不同量的替加環素加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度分別為10，100，1600ppb 的標準含藥血漿，按“血漿樣品處理”項下操作，在批內和批間對每種濃度各做5份樣品，記錄色譜圖，計算濃度，求得批內和批間精密度，結果見表5。
表5. 血漿中替加環素日內和日間精密度（n=5）
分別取不同量的替加環素加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度分別為10，100，1600ppb 的標準含藥血漿，按“血漿樣品處理”項下操作，在日內和日間對每種濃度各做5 份樣品，記錄色譜圖，計算濃度，并與加入的標準濃度比較，結果見表6。
表6. 血漿中替加環素準確度（n=5）
3.5 穩定性
分別取不同量的替加環素加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度分別為10，100，1600ppb 的標準含藥血漿，按“血漿樣品處理”項下操作，對每種濃度各做25 份樣品，5份處理后在自動進樣器中放置24h；5 份在室溫放置4h 后按“血漿樣品處理”項下操作，進樣分析；5 份于配制好后-20℃冷凍后取出自然解凍，再冷凍再解融（反復凍融3 個循環）后按“血漿樣品處理”項下進樣分析；5 份在-80℃冷凍兩周后按“血漿樣品處理”項下操作，進樣分析；5份在-80℃冷凍四周后按“血漿樣品處理”項下操作，進樣分析，結果見表7。
表7. 血漿中替加環素的穩定性（n=5）
3.6 回收率
分別取不同量的替加環素加入到空白血漿中，配成0.2mL的濃度分別為10，100，1600ppb 的標準含藥血漿，按“血漿樣品處理”項下操作，記錄樣品峰面積與內標峰面積ƒx(ƒx=As'/Ai）；10，100，1600ppb 樣品直接進樣后記錄峰面積與內標峰面積比值ƒs(ƒs=As/Ai）, 計算ƒx 和ƒs 的比值即得到替加環素的回收率，平行操作5 次，結果見表8。
表8. 血漿中替加環素的回收率（n=5）
4. 方法學小結
本實驗建立了測定血漿中替加環素的LC-MS/MS 測定方法，采用適當的樣品前處理方法，血漿中的雜質不干擾樣品的測定，標準曲線線性范圍為5ppb-2000ppb, 線性關系良好，最低定量限為5ppb；方法學確證的高、中、低三種濃度的批間和批內變異均小于10%；準確度為95.05%-102.35%；回收率為93.96%-105.63%；血漿中的替加環素在室溫放置4h、反復凍融3 次、處理后的樣品在自動進樣器放置24h 以及在-80℃冰箱冷凍兩周和四周，樣品依然穩定，符合生物樣品測定要求。
5. 血漿樣品測定結果
受試者連續多次給予藥物替加環素后，血漿中的替加環素濃度見表9。
表9. 受試者的替加環素血漿藥物濃度
6. 結論：
TSQ Vantage 三重四極桿液質聯用系統檢測血漿中替加環素具有靈敏度高、特異性好的優點，檢測限可以做到100ppb；該方法具有寬的線性范圍（5ppb-2000ppb），良好的精密度和準確度；同時使用20% 的三氯乙酸沉淀蛋白的方法處理血漿樣品，簡單快捷，空白基質沒有干擾，回收率可以達93.96%-105.63%，證明該方法檢測血漿中的替加環素具有很好的適用性。
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