運用ACQUITY Arc可靠地對肽圖分析方法進行轉換

Brooke M. Koshel和Sean M. McCarthy

沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

 

方法轉換，ACQUITY Arc，ACQUITY QDa，肽

 

■ 無需改變方法參數即可將肽圖分析從Agilent 1100系列HPLC系統無縫轉換至ACQUITY® Arc™系統。

■ 不同ACQUITY Arc系統之間具有出色的系統間重現性。

■ 將互補的質譜信息納入到常規工作流程中。

 

 

ACQUITY Arc系統能夠在同一個平臺上運行HPLC和UHPLC分離，是一款可以填補HPLC與UPLC®之間的性能差距的LC平臺。利用Arc Multi-flow path™技術，用戶可在流路1與流路2之間輕松切換，從而實現無縫的方法轉換或改善現有方法。此前的研究表明，ACQUITY Arc系統能夠輕松轉換單克隆抗體的SEC-HPLC方法1以及CEX-HPLC方法2。這兩項研究均采用流路1來模擬HPLC分離，而且兩次分析的結果表明系統之間的相對保留時間、峰面積百分比和分離度幾乎相同。本應用紀要的目的是展示不同LC平臺之間進行肽圖分析方法轉換的等效性。

 

肽圖分析已成為生物制藥行業的一項常規分析，通常采用平臺檢測的方式進行。肽圖可用于表征蛋白質的氨基酸序列，從而對蛋白質進行鑒定以及表征翻譯后修飾。在產品的商業轉化過程中，肽圖常被用于批釋放測試或在鑒定完成后用于基因穩定性檢測3。肽圖并不是一種通用的方法，分析人員必須針對特定的目標蛋白質專門開發分析方法4。為了獲得高重現性的肽圖，每種分析方法都必須考慮酶解和分離因素，只有這樣才能準確評估鑒定結果以及與穩定性、安全性和有效性相關的關鍵質量屬性(CQA)。

 

由于為特定的蛋白質建立肽圖有一定的難度，本應用紀要將一個60分鐘的通用平臺方法從Agilent 1100系列HPLC轉換至ACQUITY Arc系統，并對方法轉換過程進行了評估。然后，在兩款不同的ACQUITY Arc系統上應用該方法，通過對比所得的結果評估系統之間的差異性。最后，除光學檢測技術之外，我們還使用ACQUITY QDa質譜檢測器演示了如何將質譜檢測技術應用于這類分析。

 

取90 μL 10 mg/mL的英夫利昔單抗，用二硫蘇糖醇進行還原處理，并使用碘乙酰胺進行烷基化處理。加入胰蛋白酶酶解樣品(酶與底物之比為1:20)，然后在37 °C下水浴18小時，

最后加入純TFA使胰蛋白酶失活。酶解后樣品的最終濃度約為0.4 mg/mL，無需進一步稀釋，直接進樣分析。

 

LC系統： 配備2489 UV/Vis檢測器和QDa質譜檢測器的ACQUITY Arc系統，流路1

配備四元泵和DAD檢測器的Agilent 1100系列HPLC系統

擴充定量環： 100 μL

吸收波長： 214 nm

采樣速率： 20 Hz

色譜柱：XBridge BEH C18 130Å,3.5 μm, 4.6 mm x 100 mm (部件號186003033)

XBridge BEH C18 XP 130Å, 2.5 μm, 4.6 mm x 100 mm(部件號186006039)

柱溫： 40 °C

流動相A： 含0.1% (v/v) TFA的H2O

流動相B： 含0.1% (v/v) TFA的乙腈

樣品溫度： 4 °C

進樣體積: 75 μL

 

 

采樣速率： 2 Hz

質量數范圍 ： 350 to 1250 Da

錐孔電壓： 10 V

毛細管電壓： 1.5 kV

探頭溫度： 500 °C

 

Empower 3 CDS軟件，SR2

 

從Agilent 1100系列HPLC系統到ACQUITY Arc系統的HPLC肽圖方法轉換實現了方法等效性

 

為了評估肽圖方法從Agilent 1100系列HPLC系統轉換到ACQUITY Arc系統時的方法等效性，我們采用如上所述的方法參數建立了英夫利昔單抗的肽圖。根據以前的評估結果，我們在

ACQUITY Arc系統中配置了一個主動預加熱器(CH-30A)，以確保兩個系統可實現相當的溫度控制水平5。首先在Agilent 1100系列HPLC系統上運行分離，建立一個基準結果(圖1A)。然后，維持所有方法參數不變，將該方法轉換至ACQUITY Arc系統。實驗結果表明，兩個系統之間存在185 μL的梯度補償體積。因此我們在進樣之后應用Gradient SmartStart技術6來補償兩個系統之間的延遲體積差異。該功能可相對于進樣對梯度進行調節，而無需更改梯度表。ACQUITY Arc系統所得的色譜圖如圖1B所示。兩個系統生成的色譜圖顯示出良好的一致性。

 

 

圖1：圖1. 英夫利昔單抗的肽圖對比，分別采用A)Agilent 1100系列HPLC系統和B)應用了梯度補償的ACQUITY Arc系統采集數據。實驗計算了所有標記峰的相對保留時間。色譜峰的選擇由洗脫位置和強度決定。相對保留時間依據峰1計算。

 

為進一步評估結果的可比性，我們研究了保留時間。表1列出了52個峰的保留時間，兩個

系統所得的對應色譜峰的保留時間之間略有差異，而對應色譜峰的相對保留時間之間的

差異小到可以忽略不計。借助采用GradientSmartStart技術的流路1，我們在不改變任何方

法參數的前提下成功地將HPLC方法轉換到了現代LC平臺上。

 

表1. 比較圖1中Agilent 1100系列HPLC系統和ACQUITY Arc系統鑒定出的52個色譜峰的保留時間。采用Gradient SmartStart技術補償兩個系統之間的延遲體積差異。通過計算所得的

 

 

在整個實驗室或其它分析場所中部署新的儀器平臺時，確保分析結果的一致性是非常重要的。

為了比較不同ACQUITY Arc系統的分析結果，我們采用具有相同核心配置的兩套不同的ACQUITY Arc系統，在如上所述的方法條件下執行分析并采集了數據。這兩套系統都配置了30 cm CH被動預加熱器。每套系統分析時所采用的流動相和樣品都是單獨制備的，以模仿實際工業環境中不同分析人員在不同實驗室內執行樣品分析的情形。如圖2所示，兩個系統所得的英夫利昔單抗肽圖具有良好的一致性。評估兩個系統的相對保留時間差異之后可知，相對保留時間的差異不超過0.006(如表2所示)。采用同一平臺的兩臺不同儀器獲得了幾乎相同的結果，表明了分析結果的可靠性。

 

圖2. 比較兩套不同的ACQUITY Arc系統獲得的英夫利昔單抗肽圖：A) ACQUITY Arc系統1和B) ACQUITY Arc系統2。實驗計算了所有標記峰的相對保留時間。色譜峰的選擇由洗脫位置和強度決定。相對保留時間依據峰1計算。

 

在常規的肽監測分析中，我們通常僅使用光學檢測技術測定樣品的相對保留時間和峰面積，然后將這些數據與參比標準品的數據進行對比，用以確定分析結果是否符合適應性標準。通過引入ACQUITY QDa質譜檢測器作為正交檢測方法，我們可借助它提供的質量數信息獲得更加可靠的產品一致性分析結果。為了獲得上述肽圖方法的質譜數據，我們在光學檢測器之后串聯了ACQUITY QDa質譜檢測器。本實驗采用了填充小粒徑顆粒的色譜柱，目的是充分利用ACQUITY Arc系統能夠同時運行HPLC和UHPLC分離的優勢。本示例用2.5 μm色譜柱替代了3.5 μm色譜柱。我們并未因色譜柱粒度改變而對方法進行縮放，而是沿用了之前的60分鐘分析方法，這樣可以充分利用小粒徑色譜柱帶來的分離度和峰容量優勢。

 

表2. 比較圖2中兩套不同ACQUITY Arc系統鑒定出的52個峰的保留時間。系統之間的保留時間差異極小。由計算的_值可知，相對保留時間幾乎一樣。

 

圖3A展示了使用3.5 μm色譜柱在Agilent 1100系列HPLC系統上獲得的色譜圖，以便進行比較(另見：圖1A)。圖3B展示了使用2.5 μm色譜柱在ACQUITY Arc系統上獲得的結果，圖3C展示了相應的質譜響應。將色譜柱粒徑由3.5 μm降至2.5 μm，可以觀察到微小的分離度差異。UV/Vis數據與相應的質譜數據高度相關，表明ACQUITY QDa質譜檢測器可應用于常規分析。

 

ACQUITY QDa質譜檢測器的引入，能夠在完成色譜峰表征之后為分析人員提供確證鑒定結果所需的質譜數據，幫助他們進行批釋放測試和產品批次間的比較分析。以肽序列ASQFVGSSIHWYQQR為例，粗體部分表示互補決定區(CDR)序列。根據肽的平均質量1794.0 Da，我們可計算出相應電荷態離子[M+1H]+1、[M+2H]+2和[M+3H]+3的質量分別為1795.0 Da、898.0Da和599.0 Da。圖4A中光學積分峰的質譜數據與圖4B中峰頂點的質譜數據相當。我們為ACQUITY QDa質譜檢測器設定的掃描范圍為350 m/z到最大值1250 m/z。從圖4B的質譜數據中我們可以觀察到不同電荷態都可以落在該掃描范圍內。在實驗室環境中完成表征之后，進一步獲取質譜數據有助于分析人員對產品進行確認。

 

圖3. 英夫利昔單抗的肽圖對比，分別采用A) Agilent 1100系列HPLC系統和B) ACQUITY Arc系統采集數據，圖C)則為通過ACQUITY QDa質譜檢測器獲得的相應質譜數據。Agilent 1100系列HPLC系統采集數據數據時使用的是填充3.5 μm顆粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱，而ACQUITY Arc 系統采集數據時使用的是填充2.5 μm顆粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱。相應的質譜數據與光學數據高度相關。

 

圖4. 來自ACQUITY Arc系統的英夫利昔單抗肽圖的放大圖，分別展示了A)光學數據以及B)光譜積分峰的相應質譜數據。采集數據時使用的是填充2.5 μm顆粒的XBridge BEH C18130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱。圖B)中所示的電荷態分別對應為肽序列ASQFVGSSIHWYQQR(粗體部分代表CDR序列)的[M+1H]+1和[M+2H]+2計算所得的值。

 

生物制藥行業已經認識到了應用新技術和新方法的重要性，紛紛向實驗室中引入ACQUITY Arc系統等現代化的LC平臺。隨著分析方法越來越頻繁地在整個機構中進行轉換或轉換到合同研究機構中，我們需要證明分析方法在相同及不同的類似儀器平臺上能夠獲得一致的結果。ACQUITY Arc系統不僅可以模擬傳統的HPLC方法，還能應用Arc Multi-flow path技術將HPLC方法升級為UHPLC方法。通過將HPLC方法升級為UHPLC方法并結合ACQUITY QDa質譜檢測器，我們可以將常規的質譜檢測結合到分析中，以利于結果的確認。

 

參考文獻

1. Koshel, B. M., McCarthy, S. M. Transfer of an SEC Method for Monoclonal Antibody Analysis from HPLC to UHPLC using the ACQUITY Arc System. 2015; 720005510en.

2. Koshel, B. M., McCarthy, S. M. IEX Method Transfer: Replicating a Method for Monoclonal Antibody Analysis on an ACQUITY Arc System. 2015; 720005529en.

3. Luo, Y. et al. Handbook of Modern Pharmaceutical Analysis.In Separation Science and Technology; Ahuja, S.;Scypinski, S., Ed.; Academic Press: Burlington, MA, 2010;Vol. 10; pp 283–359.

4. U.S. Pharmacopeial Convention, General Chapter <1055>Biotechnology-Derived Articles- Peptide Mapping,USP38-NF33, Official from August 1, 2015.

5. Hong, P., McConville, P. R. Method Transfer from Agilent 1100 Series LC System to the ACQUITY UPLC H-Class System: The Effect of Temperature. 2015; 720005204en.

6. ACQUITY Arc System Brochure. Waters Brochure. 2015;720005393en.

 

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