Western Blot中蛋白樣品的制備與試劑選擇

    "良好的開始是成功的一半"，尤其對于生物學實驗，如果沒有高質量的實驗樣本，等待我們的很可能是失敗的實驗結果。優質特異的蛋白樣品對Western Blot實驗至關重要。下面將從蛋白樣品制備的方法和試劑選擇上給大家一些建議，同時也和大家分享一些因蛋白樣品制備不當而導致Western Blot實驗失敗的案例。

√ 蛋白樣品制備的基本原則

    目的蛋白因其物種來源和組織特異性的不同，在種類和性質上有很大差異，因此并沒有一種制備方法可以適用于所有蛋白的提取。這就需要我們進行全面的分析后才能選擇最合適的蛋白制備方法，在這個過程中遵循的一個基本原則是"知己知彼"。

    首先，"知己"是要了解：樣品是來自什么物種？目的蛋白定位在哪種組織或細胞器？是可溶蛋白還是不可溶蛋白？是高豐度蛋白還是低豐度蛋白？在制備時需要保持蛋白的天然活性，還是需要變性蛋白？

    其次，"知彼"是要知道：哪種方法或試劑能夠防止蛋白降解、聚集、沉淀、變性、修飾？哪種能夠去除高豐度蛋白干擾，富集低豐度蛋白？哪種能去除核酸、多糖、脂肪等雜質？哪種能在有限的實驗條件下，簡便快速地獲得高純度且完整性好的蛋白？

    遵循"知己知彼"的原則對蛋白樣品制備進行全面分析，就能明確蛋白樣品制備的合適方法或試劑。

√ 細胞組織裂解液的選擇

    裂解液是最普遍使用的蛋白提取試劑，可根據文獻或經驗自行配制，也可購買商業化的產品。常見的細胞裂解液有NP40、Triton X-100、RIPA buffer等。下表是根據目的蛋白的不同定位選擇裂解液的建議。雖然裂解液的使用范圍比較廣泛，能夠滿足總蛋白的提取，但是無法做到特異蛋白的提取，特別是遇到低豐度蛋白或者活性蛋白功能分析時，通用型的裂解液存在很大的局限性。

√ 蛋白抽提試劑盒的選擇

    蛋白抽提試劑盒的出現彌補了細胞裂解液的應用局限性，特別是針對難提取的樣本或者亞細胞器蛋白的提取，例如：針對植物、動物組織/細胞、細菌、酵母等不同樣品及細胞核、細胞膜、線粒體、葉綠體、溶酶體等不同亞細胞器的專業提取試劑盒。這類特化試劑盒能夠針對目的蛋白的不同來源和不同組織定位進行裂解和提取，簡化實驗操作的同時還能提高蛋白提取的得率。

   如Vazyme公司的總蛋白提取試劑盒：一方面，該系列試劑盒有非變性的裂解配方，可最大程度地保留蛋白活性；另一方面，該系列產品無需經過反復凍融、超聲破碎等傳統物理裂解方法，并能在很短時間內得到高純度的蛋白。

√ Western Blot中的蛋白樣品危機

    在Western Blot中如果蛋白樣品制備不當，可能會造成無信號、弱信號、條帶大小不正確等實驗問題。下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案，供參考。

    以上是關于Western Blot實驗過程中如何選擇合適的蛋白制備方法和試劑的一些建議，以及由于蛋白樣品制備不當造成實驗失敗的問題總結，希望能給大家一些幫助和啟發。此外， Western Blot還有很多關鍵的實驗環節需要注意，比如怎樣選擇高質量的抗體、怎樣保護蛋白樣品不被降解、怎樣配制合適的SDS-PAGE凝膠等，都應操作小心謹慎。