細胞活力檢測方法的介紹

細胞活性是判斷體外培養細胞在某些條件下是否能正常生長的重要指標，如藥物處理、放射性或紫外線照射、培養條件變化等。細胞活性檢測方法有很多種，如臺盼藍染色法、克隆（集落）形成法、、ATP含量測定法、熒光染色法、比色法（MTT法）等。

一、ATP含量測定法---生物發光檢測

有研究表明內源性三磷酸腺苷 (ATP) 的數量可以反映細胞的活性度，內源性ATP是活體細胞最基本的能量來源，細胞死亡時，ATP迅速水解。因此，測定細胞內源性ATP的含量可以及時反映細胞的活性和活細胞數量。基于ATP的細胞活力檢測法是一種敏感而可靠的檢測方法。

反應原理是活細胞在有氧和ATP的條件下，熒光酶催化熒光素發出熒光 (波長為562nm)，強度與ATP含量呈正相關。故所測得熒光強度可間接反映出存活細胞量。

Promega CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay是基于ATP檢測的快速細胞活力檢測法。（目錄號：G7570）

-檢測類型：發光

-檢測標志物：ATP

-應用：細胞活力，細胞增殖，細胞毒性

-細胞類型：細胞系，原代細胞(懸浮或貼壁)

-檢測步驟：一步法，均質檢測

-操作時間：10min

-靈敏度：10個活細胞(96孔板)   

二、 熒光法檢測

一些熒光染料對死細胞和活細胞有不同的作用效果，利用熒光顯微鏡檢測細胞活性。如碘化丙錠 (PI) ，被活細胞排斥但能穿透正在死亡或已經死亡細胞的細胞膜，因此活細胞不被染料染上色，只有死細胞或是凋亡細胞才能染上紅色。吖啶橙 (AO) 能透過質膜完整的細胞，嵌入細胞DNA，使之發出明亮的綠色熒光。溴化乙錠 (EB) 僅能透過胞膜受損的細胞，嵌入DNA，發橘紅色光。也可應用AO-EB雙染法鑒定細胞活性。這種檢測方法相比傳統的染料，具有靈敏度高，操作簡便，結果容易分辨等特點，而且利用雙染法還可以分辨活細胞、凋亡早期細胞、凋亡晚期細胞、死亡細胞。在細胞凋亡的檢測上有很廣泛的應用。

Alamar Blue是一種安全、穩定、易溶于水、且對細胞無毒的新型染料，可通過熒光產生或顏色變化指示細胞的代謝。活細胞線粒體酶能夠將藍色的氧化形式Alamar Blue變成紅色的還原形式，同時發生可量化的熒光變化，無活性的細胞不能還原Alamar Blue 。熒光的強度或紅色的強度反映了細胞增殖的程度，其顏色變化可用酶標儀測定；熒光變化可用熒光測定儀檢測，激發波長530nm，散射波長590nm，使用熒光方法時具有更優秀的敏感性。AlamarBlue法操作簡便，特異性和靈敏度高，重復性好，且AIamar Blue的使用不影響細胞正常代謝及基因表達，可在無菌條件下測定后繼續培養擴增細胞，有利于對培養細胞的連續監測及深入研究。但由于Alamar BIue的分解產物是偏紅色的，所以只能用無酚紅培養基，且對培養的時間要求也相對MTT法來說要苛刻。

Promega CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay是一種革新性熒光法，是非裂解性的活細胞檢測法，用于檢測活細胞的活力狀態和數量。（目錄號G6080）

原理：該系統檢測的是活細胞內的蛋白酶活性，該蛋白酶為保守的組成型蛋白，因而可作為細胞活力的生物標志物。該活細胞蛋白酶活性僅與完好的活細胞有關，是通過一種可穿透細胞膜的、可產生熒光的肽底物（Gly-Phe-AFC）來檢測的。該底物進入活細胞后，被活細胞蛋白酶切割，產生熒光信號，該信號的強度與活細胞數量相關。當細胞膜的完整性喪失，以及漏出到周圍培養基后，該活細胞蛋白酶的活性即消失。

-檢測標志物：活細胞蛋白酶

-檢測類型：熒光(380-400nm激發光/505nm發射光)

-應用：細胞活力，細胞增殖，細胞毒性，疊加檢測

-細胞類型：細胞系，原代細胞(懸浮或貼壁)

-檢測步驟：一步法，均質檢測

-操作時間：0.5-3h

-靈敏度：40個活細胞(96孔板)

三、 比色法檢測

MTT比色分析法是由Mosmann在1983年首創，其原理是活細胞內的線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以將MTT[化學名為3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽，外觀淡黃色]還原成藍紫色結晶甲臜，并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜 (DMSO) 能溶解細胞中的甲臜，溶液顏色的深淺與所含的甲臜量成正比。用酶標儀在570nm波長下測定OD值。MTT方法能簡單、快捷、準確地測定細胞的增殖反應，而且能避免由于人為操作因素造成的試驗誤差，大大地提高了實驗結果的準確性和重現性。MTT方法目前大多用于檢測培養細胞的生長和增殖、新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤細胞敏感性試驗等。加之其價格低廉，成為日前各實驗室榆測細胞活性的首選方法之一。

但是MTT法不太適合于懸浮細胞，因為在溶解甲臜之前，需將培養液吸出，這一步很容易造成甲臜流失，因而導致實驗結果偏差。若不去除培養基，培養基中的血清和酚紅會影響實驗結果。為了消除培養液中血清和酚紅的影響，有人進一步提出改良的MTT法。即在不吸出培養基的前提下，利用一些有機溶劑，如酸化SDS、SDS-DMF酸性溶解液等直接溶解甲臜，都取得了不錯的效果。

對由于MTT的產物甲臜不溶于水的缺點，研究人員又開發了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如 XTT、CCK-8 (又稱WST-8) 等。XTT和CCK-8都是新合成的四唑氮衍生物，與MTT屬于同類物質，它們都能被活細胞中線粒體內的脫氫酶降解而產生棕黃色水溶性的甲臜，能直接通過光譜吸收測定OD值，進而推測細胞的增殖情況。當與電子耦合劑PMS聯用時，還能增強其還原反應，提高反應的靈敏性。與MTT法比較可知，這些方法主要優點是反應產物為水溶性，不需要使用裂解液溶解沉淀，也不需要吸取上清，對貼壁和懸浮生長的細胞均適用，檢測時間縮短和處理步驟減少，也大大提高了實驗的敏感性。缺點就是成本較高，XTT水溶液不穩定，需要低溫保存或現配現用；而CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，不注意的活容易產生漏加或多加。

Promega CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS單溶液一步法細胞活力檢測試劑盒)是一種比色法的新型細胞活力快速檢測試劑。一步法操作，擺脫了傳統MTT操作復雜問題，誤差小，無需有機溶劑溶解，無需去除上清，活細胞檢測等。（目錄號G3582 G3580 G3581 ）

-檢測類型：吸收光(490nm)

-檢測標志物：線粒體脫氫酶

-應用：細胞活力，細胞增殖，細胞毒性

-細胞類型：細胞系，原代細胞(懸浮或貼壁)

-檢測步驟：一步法，均質檢測

-操作時間：1-4h

-靈敏度：1000個活細胞(96孔板)