ChIP實驗的三大法寶

在基因調控領域，可以說沒有比表觀遺傳學更熱的話題了。而染色質免疫共沉淀ChIP是表觀遺傳學研究中最常用的方法。  

ChIP通過針對染色質相關蛋白（組蛋白、轉錄因子等）的抗體，來鑒定與該蛋白（或蛋白修飾）相連的序列。這種方式能夠幫助人們定位基因組中發生的表觀遺傳學改變。舉例來說，針對H3K4me3（賴氨酸-4上的組蛋白H3三甲基化）的抗體可用來檢測活躍表達的基因，而針對H3K27me3的抗體可用于檢測沉默的基因。

類似的技術還包括RIP（RNA免疫沉淀）和MeDIP（甲基化DNA免疫沉淀）。RIP可以幫助人們鑒定，與特定RNA結合蛋白相連的RNA。而MeDIP技術允許研究者pull down甲基化的染色質序列。

 

一、提高染色質的質量

與絕大多數實驗方法相同，ChIP也遵循著GIGO原則（Garbage in, garbage out）。如果你的染色質原材料不佳，當然就很難得到理想的實驗結果。同時如果你的原材料OK,下一步片段化處理沒有做好，仍然是徒勞。

 

目前人們一般通過超聲或者酶切將染色質片斷成幾百Bp，但普通超聲破碎儀很難拿捏。超聲時間過長或力度過強都會令蛋白變性，使其與核酸分離或者破壞抗體識別的抗原表位。這種方案需要進行大量的優化，但過多的參數（比如四個需要考慮的關鍵參數：細胞密度、超聲力度、超聲時間和循環數）往往令人難以下手。幸虧目前有一款超聲破碎儀，那就是Diagenode公司生產的Bioruptor 高通量非接觸式超聲破碎儀，他一次最多可以處理12個樣品，由于它可以處理多個樣品，把復雜的多參數影響直觀數據化，解決了繁雜的參數誤差，做到準確可控，快速獲得最佳實驗條件，從而獲得更加準確的實驗數據，很多科研人員稱它為ChIP實驗的神器、金標準，可謂名副其實。

另外有些科研人員喜歡用酶切的方法，酶切的方法其實可以加入超聲步驟，超聲有助于從細胞核釋放更多的染色質。不過為了簡單直接，單純的酶切處理更為普遍。 要說明的是，酶學片段化方案也存在著一定的弊端，因為核酸酶有時會表現出序列偏好，從而影響結果的真實性。另外，酶學消化也并不總能與甲醛交聯（ChIP的一個關鍵步驟）兼容。

 

二、保證抗體的質量  

用來進行pull-down的抗體，是成功ChIP的另一個關鍵因素。與Western blot相比核酸IP對抗體的要求更多。舉例來
說，Western blot抗體識別的是變性蛋白。但在ChIP應用中，你需要確保抗體識別蛋白的三級結構或者一個暴露的抗原表位。

最好的辦法是選擇一款經ChIP（或RIP或MeDIP）驗證的抗體。例如，Digenode公司提供一系列已驗證的抗體。該公司致力于表觀遺傳學研究的服務領域，生產高品質的抗體，同時也為ChIP實驗設計了Bioruptor系列超聲剪切產品。確保使用高質量的抗體，是ChIP實驗成功的關鍵，不可遷就，舍本求末。

 

三、控制細胞數

ChIP一般使用體外培養的細胞，每次反應所需的細胞量因地制宜。現在，人們常常需要研究更為特殊的樣本，例如腫瘤、組織活檢樣本、干細胞、已存檔的FFPE樣本（甲醛固定石蠟包埋）、流式細胞分選或激光捕獲顯微切割所富集的細胞。在這些情況下實驗所需的細胞量取決于研究的對象，組蛋白修飾比較豐富，需要的樣本量也就相對較少。而轉錄因子豐度較低，一般需要大約一百萬細胞，不過如果信噪比高，那么樣本量也可以適當減少。