在MD兩款酶標(biāo)儀上應(yīng)用Promega CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞活性

 

Molecular Devices公司的SpectraMax® L及SpectraMax®M5型號(hào)酶標(biāo)儀結(jié)合Promega公司的CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒能進(jìn)行快速靈敏的活細(xì)胞數(shù)量測(cè)定。CellTiter-Glo檢測(cè)法使用了螢光素酶，需要ATP使其反應(yīng)發(fā)光。發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度由ATP量決定，而ATP的多少取決于活細(xì)胞數(shù)目。SpectraMax® L及M5酶標(biāo)儀均能提供96孔和384孔化學(xué)發(fā)光檢測(cè)功能。

 

CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(Promega公司，貨號(hào)G7570)，包括CellTiter-Glo緩沖液和CellTiter-Glo底物(凍干粉)

CHO-K1細(xì)胞(ATCC，貨號(hào)CCL-61)

白色96和384孔板(Greiner Lumitrac 200，貨號(hào)655075和781075)

SpectraMax® L化學(xué)發(fā)光微孔板檢測(cè)儀或SpectraMax® M5多功能微孔板讀板機(jī)

 

準(zhǔn)備CellTiter-Glo試劑使用前將CellTiter-Glo緩沖液和底物在室溫中平置解凍。然后將緩沖液倒入裝有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手冊(cè)中指示，溫和顛倒瓶子以混勻。

 

用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham’sF12培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞。胰酶消化后使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用96孔板檢測(cè)時(shí)，每孔中加入100ul細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度從50000個(gè)/孔稀釋到24個(gè)/孔。384孔進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，每孔中加入25ul懸液，細(xì)胞濃度從12500個(gè)/孔稀釋到25個(gè)/孔。空白孔中加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，用于檢測(cè)背景光值。

 

為了確保CellTiter-Glo檢測(cè)中細(xì)胞數(shù)量的準(zhǔn)確性，細(xì)胞不能貼壁和生長(zhǎng)，但能及時(shí)被檢測(cè)到。每孔中加入100ul(96孔板)或25ul(384孔板)CellTiter-Glo試劑。然后將微孔板放在振蕩器上溫和振蕩混勻2分鐘，室溫孵育10分鐘，使其產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號(hào)。

 

ATP標(biāo)準(zhǔn)樣品用培養(yǎng)基制備，濃度范圍從100 fmol/孔到1nmol/孔(96孔板)，或25 fmol/孔到250 pmol/孔(384孔板)，按上述同樣體積加入微孔板中。空白對(duì)照孔加入不含ATP的培養(yǎng)基。適量CellTiter-Glo試劑加入每孔，并按上述步驟孵育。

 

檢測(cè)板用SpectraMax® L和SpectraMax®M5酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)，并使用SoftMax® Pro軟件中預(yù)設(shè)參數(shù)的CellTiter-Glo模板。根據(jù)Promega推薦，檢測(cè)時(shí)間設(shè)置為1秒。然后在SoftMax® Pro軟件上進(jìn)行平均發(fā)光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，細(xì)胞濃度稀釋曲線和ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖。

 

SpectraMax® L和SpectraMax® M5酶標(biāo)儀均最低能檢測(cè)24個(gè)細(xì)胞/孔(96孔板)和6個(gè)細(xì)胞/孔(384孔板)。因此其靈敏度高于比色法和熒光檢測(cè)法。CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光檢測(cè)值在所用的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)呈線性分布，并達(dá)到大于3個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍(r2= 0.99)。(見圖1)

 

ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線能用于驗(yàn)證試劑盒以及計(jì)算細(xì)胞ATP含量。ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線中ATP濃度范圍對(duì)應(yīng)檢測(cè)值覆蓋了細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)中的發(fā)光值全部范圍(見圖2)。檢測(cè)值至少在4個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)呈線性。

 

 

 

 

 

SpectraMax® L和SpectraMax® M5酶標(biāo)儀均為CellTiter-Glo檢測(cè)提供了優(yōu)異的檢測(cè)靈敏度。SpectraMax® L化學(xué)發(fā)光讀板機(jī)帶有自動(dòng)增益功能，能同時(shí)進(jìn)行模擬信號(hào)和光子計(jì)數(shù)，提供大于9個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍，對(duì)于高信號(hào)值樣品無需稀釋，同時(shí)對(duì)于低信號(hào)樣品具有優(yōu)越的靈敏度。

 

SpectraMax® M5多功能讀板機(jī)為使用者提供了除化學(xué)發(fā)光以外的其他檢測(cè)方法，例如：光吸收，熒光強(qiáng)度，熒光偏振和時(shí)間分辨熒光。

 

SpectraMax® L和SpectraMax® M5酶標(biāo)儀均用SoftMax® Pro軟件進(jìn)行操控和設(shè)置，該軟件含有CellTiter-Glo檢測(cè)模板和其他120多個(gè)分析模板，這些模板已預(yù)設(shè)參數(shù)，方便數(shù)據(jù)整理和分析。兩種酶標(biāo)儀均能整合MD公司的StakMax®微孔板移動(dòng)機(jī)械臂，以實(shí)現(xiàn)微孔板的自動(dòng)裝卸。