Western blot常用封閉液及注意事項(xiàng)

在做Western blot實(shí)驗(yàn)中，會(huì)用到固相載體（如NC膜，PVDF膜），在這些固相載體表面有很多洞洞，通過電轉(zhuǎn)，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到膜上，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)（堆積）和吸附的方式結(jié)合于表面。蛋白塞進(jìn)了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是連續(xù)的，而有很多空隙，抗體也是蛋白，也會(huì)被吸附在空的洞里，這樣就會(huì)有很多非特異性的信號(hào)。

封閉液中的蛋白可以與固相載體表面的空白位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)（堆積）和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因?yàn)橛小疤钛a(bǔ)”和覆蓋“蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異性結(jié)合，所以有”封閉“的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠狠牢固的結(jié)合在空白位置上，這樣抗體蛋白就不會(huì)被非特異性的吸附到膜上，而只會(huì)跟特異性蛋白結(jié)合。

封閉液應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點(diǎn)而不替換表面上的靶蛋白，不結(jié)合靶蛋白表位，也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng)。

常見的封閉液：

   BSA是最常用的封閉液，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的，BSA有很強(qiáng)的免疫原性，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多針對(duì)BSA的抗體，為避免交叉反應(yīng)，不能用BSA，脫脂奶粉封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉液。

封閉血清的原理主要有兩點(diǎn)，第一是待測(cè)樣本有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì)，從而導(dǎo)致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分分特異性的結(jié)合，從這點(diǎn)看，BSA和血清沒有明顯區(qū)別。第二待測(cè)樣品中可能會(huì)有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結(jié)合，BSA無法封閉Fc受體。

   脫脂奶粉最大的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜，但由于成分相對(duì)復(fù)雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會(huì)導(dǎo)致背景增加，此外，因?yàn)樽陨砗�有生物素，不能用于生物素�?biāo)記的抗體系統(tǒng)。脫脂奶粉種含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留，在使用生物素-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗時(shí)，也會(huì)使得高背景或本底水平增高。