利用SpectraMax Paradigm多功能檢測平臺同時進行細胞凋亡和細胞壞死的篩選工作-Molecular Devices
簡介
細胞凋亡和細胞壞死的本質均為細胞死亡，但我們可以通過其發生機制和病理形態學方面所表現出的特征加以區別。細胞凋亡指的是細胞程序性的死亡，不會發生細胞膜損傷；細胞壞死則被認為是因病理而產生的被動死亡，會伴隨發生細胞膜損傷，導致細胞質因子的釋放并引起炎癥反應。進行抗腫瘤藥物篩選過程中，區分引起的是細胞調亡和細胞壞死變得非常重要，因為后者的主要副作用是引起細胞的炎癥反應。這里我們介紹了利用SpectraMax Paradigm（Molecular Devices）和 Vybrant 凋亡檢測試劑盒（Invitrogen）進行這方面的研究。
試驗描述
Vybrant細胞凋亡檢測試劑盒是基于Annexin V和Sytox Green兩種標記物的基礎上開發出的，可以快速和簡便的區分腫瘤細胞的凋亡和壞死情況。Annexin V是一種人類血管抗凝劑，標記藻紅蛋白（R-PE）后通常用來檢測凋亡細胞的發生。其工作原理是正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙分子層的內側，當細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側，Annexin V是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸具有高度的親和力。相反，Sytox Green染料不能滲透進入活細胞和凋亡細胞，但可以進入壞死細胞并對其細胞核進行染色，發出很強的綠色熒光。我們提前將腫瘤細胞種在384孔板中，然后分別使用腫瘤壞死因子（TNF）和放線菌素D（Actinomycin-D）來誘導細胞凋亡，使用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)誘導細胞壞死。此外，我們可通過檢測細胞組織表達的不同物質的抗腫瘤特性和分化特性來區分細胞凋亡和細胞壞死。
使用不同的檢測方法來檢測腫瘤細胞的凋亡及壞死
SpectraMax Paradigm是美國Molecular Devices公司推出的一種全新概念的多功能檢測平臺（圖一）。它將光源系統和檢測系統獨立分開，多套檢測器同時固定在主機上，針對不同實驗要求選用不同的卡盒，每一種卡盒其實就是獨立的光路系統，可以提高檢測針對性和靈敏性。針對此試驗特點，如果儀器具有能夠同時檢測Annexin V和Sytox Green兩種標記物發射熒光強度的話可大大提高檢測的效率（圖二），而Paradigm所具有的雙通道檢測器可同時工作，非常適合此類試驗要求。
圖一：SpectraMax Paradigm多功能檢測平臺
圖二. 1:HepG2細胞提前24小時種在平底的384孔板中，這些孔中的一部分細胞未經任何處理，而另一部分細胞試驗前18小時分別用TNF(25ng/ml)、Actinomycin-D（1ug/ml）和Triton X-100(0.1%)孵育，然后去除微孔板中培養基，將兩種標記物分子溶解在緩沖液中，37度孵育20分鐘。染色后，分別使用SpectraMax Paradigm 多功能檢測平臺的single-point(a)、on-the-fly(b)和area-scan(c)模式檢測結果，每個柱高度代表著平均熒光強度值（RFU）和5個重復孔的標準偏差。可以看出掃描孔內面積越大，得出結果就會更加的精確，尤其適合像腫瘤細胞這種單層不均一類型細胞的檢測試驗。
結論
綜上我們可以發現，SpectraMax Paradigm是基于細胞學應用的理想檢測平臺， 從使用Vybrant細胞凋亡檢測試劑盒所呈現的結果中發現，孔內細胞層的變化非常快速而且對整個試驗結果的影響較大，Paradigm所具有的“On-the-fly”數據收集模式可以很好的解決此問題。高速的雙發射檢測器可針對每個孔測量的多數據點畫出線性圖，從而得到一個更大測量區域的數值，將會得出更好的數據統計結果。當使用“area scan”功能后可以進一步提高基于細胞學應用試驗數據的質量。此外，此款儀器所具有的雙通道同時檢測的功能可以大大縮短檢測時間，提高篩選工作的效率。
致謝
非常感謝奧地利克雷姆斯高等專業學院醫藥生物技術部門所提供的研究數據。
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