開發用于腦脊液中多種β淀粉樣肽的SPE/LC/MS/MS定量測定方法
Erin Chambers1、Mary E. Lame2、Diane M. Diehl2、Sarah Grimwood2和Yanhua Zhang3
1沃特世公司，美國馬薩諸塞州米爾福德，01757；2輝瑞制藥公司神經科學研究部，美國康涅狄格州格羅頓，06340；3輝瑞制藥公司PDM部，美國康涅狄格州格羅頓，06340
引言
β淀粉樣肽（Aβ）的不溶性聚集物在腦中沉積／形成被看作為早老性癡呆病（AD）的一個關鍵事件。治療策略集中于用以減少β淀粉樣肽生成或提高其清除水平的小分子抑制劑或免疫療法。因此，找到能對腦脊液中的淀粉樣肽進行高靈敏且穩定可靠的定量分析方法以確定其與AD關系對很多研究者來說至關重要。然而，對這些Aβ肽的分析極具挑戰性，這不僅因為其在生物液體內的豐度相對偏低，而且也因為它們可能被其它蛋白質結合并具有形成低聚體的趨勢。
這些肽的測定常規采用免疫測定法（因其選擇性和靈敏度）或者通過冗長的免疫沉淀之后再進行SPE。免疫測定所需的方法開發時間比LC/MS/MS方法開發時間長；它們需要對多種Aβ肽進行多次測定，并且與LC/MS/MS相比其線性動態范圍有限。免疫測定存在交叉反應性和非特異性結合，需要使用價格昂貴的抗體，并且樣品／標本的富集依賴于抗體的選擇性。免疫測定的勞動強度大，并且測定不準確和基質干擾也是常見的問題。因此，需要開發一種基于LC/MS/MS的高通量、選擇性好的生物分析方法，使樣品制備能夠實現在存在高濃度干擾蛋白和肽的情況下回收得到pg/mL水平的淀粉樣肽。
雖然開發免疫測定方法所需的時間在后期藥物發展過程中是可接受的，但在較早的階段中則幾乎不切實際；這時，如能有一種可定量多種肽的高通量且可靠的方法則是眾望所歸。
本研究工作集中于開發用于淀粉樣前體蛋白（APP）的1-38、1-40和1-42片段的LC、MS和選擇性SPE樣品制備方法，以支持臨床前研究。使用單一、高通量方法用于多種Aβ肽的分析測定而無需耗時的免疫沉淀步驟，被成功開發并經過驗證。特別是，Aβ類肽存在很多獨特的分析挑戰，其中包括非特異性結合、溶解性差、聚集和質譜靈敏度偏低。在方法開發各階段所進行的步驟盡可能減小或消除了這些問題所帶來的影響。
隨著AD病情緩解策略的出現，對除了Aβ 38、40和42之外的多種可能與AD病征相關的Aβ進行定量分析可有助于提供關于此病及其發展過程的更多認識。本文所述的方法也有可能進行相應的修改，以使其適用于那些肽的定量分析。
β淀粉樣1-38肽，分子量4132，pI 5.2
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β淀粉樣1-40肽，分子量4330，pI 5.2
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
β淀粉樣1-42肽，分子量4516，pI 5.2
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
圖1：β淀粉樣肽1-38、1-40和1-42的氨基酸序列和pI數據
實驗
UPLC®方法的條件
色譜柱： ACQUITY UPLC® BEH C18，300Å，2.1×150nm，1.7µm
流動相： A：0.3% NH4OH（按體積計算）的水溶液
B：90%乙腈，10%流動相A
梯度： 90% A保持1分鐘，5.5分鐘內降低至55% A并保持0.2分鐘，然后返回至初始水平
流速： 0.2 mL／分鐘
進樣量： 10µL
溫度： 50℃
質譜條件
系統：沃特世XevoTM TQ三重四極桿質譜儀，在ESI+MRM模式下運行
去溶劑化氣體流速：800L／小時
源溫度：120℃
去溶劑化溫度：450℃
碰撞室壓力：2.6×10(-3)毫巴
MRM躍遷態和條件：見表1
樣品預處理
用5M鹽酸胍以1:1的比例稀釋200µL腦脊液（人腦脊液、猴腦脊液或加標人工腦脊液+5%大鼠血漿），并在室溫下振搖45分鐘。然后，用200µL 的4%H3PO4水溶液進一步稀釋樣品。
注意：對于加標樣品而言，在加標后、用鹽酸胍稀釋前，可在室溫下讓樣品平衡30分鐘。
固相萃取（SPE）
基于µElution 96孔型的Oasis® MCX
預處理：200µL甲醇
平衡：200µL 4% H3PO4水溶液
上樣：600µL預處理后的樣品
清洗1：200µL 4% H3PO4水溶液
清洗2：10% ACN水溶液
洗脫：2×25µL 75:15:10 ACN:水:NH4OH濃溶液
稀釋：25µL水
進樣量：20µL
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肽名稱 |
前體離子 |
產物離子 |
產物離子ID |
錐孔電壓（V） |
碰撞能量（eV） |
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β淀粉樣1-38肽 |
1033.5 |
1000.3 |
b 36 |
33 |
23 |
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β淀粉樣1-38肽的N15內標 |
1046 |
1012.5 |
|
30 |
22 |
|
β淀粉樣1-40肽 |
1083 |
1053.6 |
b 39 |
33 |
25 |
|
β淀粉樣1-40肽的N15內標 |
1096 |
1066.5 |
|
35 |
22 |
|
β淀粉樣1-42肽 |
1129 |
1078.5 |
b 40 |
28 |
30 |
|
β淀粉樣1-42肽的N15內標 |
1142.5 |
1091.5 |
|
35 |
28 |
表1：β淀粉樣肽及其N15標記型內標的MRM躍遷態和質譜條件
圖2：β淀粉樣1-42肽的典型ESI+MS/MS光譜
結果和討論
開發這些方法所遇到的最大挑戰就是克服溶解性、吸附性和聚集性問題并獲得能滿足該應用要求的足夠選擇性和靈敏度。適當的流動相和進樣溶劑構成以及明智選擇SPE洗脫溶劑僅僅是應對這些問題的幾個關鍵因素。
質譜分析
質譜分析在正離子模式下進行，因為4+前體的CID產生了幾種與固有的特異性b序列離子相對應的不同產物離子（典型光譜如圖2所示）。負離子模式下的MS/MS出現了明顯的水分流失。圖3給出了關于兩種方法特異性區別的一個示例。雖然對于溶劑標準品時使用負離子模式的總體靈敏度較高，但在基質存在時負離子模式的靈敏度優勢減弱，而正離子模式下的特異度和信噪比的提高對于腦脊液樣品中的準確定量具有決定性作用。
超高效液相色譜分析
圖4顯示了對這三種β淀粉樣肽的分離情況。雖然流動相中NH4OH的精確百分比對負離子靈敏度具有關鍵作用，但ESI+模式下的信號經證實對流動相構成的細微變化更具穩健性，可使液相色譜／自動取樣器至少在24小時以上的時間段中保持穩定。與此相反，50%或以上的ESI-信號在10-12小時后因流動相中NH4OH濃度的自然變化（揮發）而損失。這進一步強調了ESI+MS方法的穩健性。
固相萃取（SPE）
SPE使用Oasis® MCX（一種混合模式的吸附劑）進行，以加強萃取過程的選擇性。該吸附劑同時依賴于反相和離子交換保留機制，以從復雜腦脊液樣品中的其它高豐度多肽中選擇性分離β淀粉樣肽組分。使用特定的96孔Oasis® µElution提供了明顯的濃縮效果，無需溶劑揮干和復溶，從而盡可能減少了肽損失。此外，通過離子交換進行肽結合為整個方法提供了正交性。
在最初的方法開發過程中，萃取人工腦脊液時觀察到了大量非特異性結合（NSB）。我們添加了5%大鼠血漿（有一個不同的β淀粉樣肽序列），以消除NSB。
SPE是整個方法中較為重要的環節之一。對淀粉樣組分選擇性極高的分離再加上標準流速下UPLC的分辨率實現了對臨床前研究樣品的超快分析。
線性、準確度和精確度
對每種肽均使用了N15標記型內標。對于0.1-10ng/mL人工腦脊液+5%大鼠血漿的等分樣本，三種β淀粉樣肽的標準曲線均呈線性。β淀粉樣1-38肽的典型標準曲線如圖5所示。淀粉樣肽的基線水平根據同時使用過量加標的人腦脊液和“人工腦脊液+5%大鼠血漿”而得到的兩條標準曲線進行定量分析，基線水平的計算值沒有統計學意義上的差異。選擇人工腦脊液是因為它的價格不貴，而且是一種比較易得的基質。從3種人腦脊液和1種猴腦脊液萃取得到的β淀粉樣1-42肽的基線水平如圖6所示。所有3種β淀粉樣肽的基線水平測定值的統計結果如表2所示。
用3種人腦脊液混合樣品和1種猴腦脊液混合樣品配制了0.2、0.8、2和6ng/mL的過量加標的質控樣品。準確度和精確度數值符合LC/MS/MS測定的控制標準。質控樣品分析的典型結果如表3所示。
圖3：比較使用負離子（失水產物離子）或正離子（b序列離子的產物離子）電噴霧模式的質譜特異度
圖4：UPLC/MS/MS分析萃取自人工腦脊液+5%大鼠血漿的β淀粉樣1-38、1-40和1-42肽
化合物名稱：1-38
相關系數r=0.996956，r2=0.993921
校準曲線：0.333755*X+-0.0119724
響應類型：內標（參考品2）面積*（內標濃度／內標面積）
曲線類型：線性；來源：單一；加權：1/x；橫軸：無
圖5：萃取自人工腦脊液+5%大鼠血漿中的β淀粉樣1-38肽的典型標準曲線
圖6：顯示3種人腦脊液和1種猴腦脊液中β淀粉樣1-42肽基線水平的典型色譜圖
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表2: 3種人腦脊液混合樣品和1種猴腦脊液混合樣品中β淀粉樣肽的基線水平
β淀粉樣1-38肽
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過量加標濃度
ng/mL |
質控品濃度 |
平均計算濃度 |
標準偏差 |
% CV |
重復檢測的合格次數 |
平均準確度 |
|
|
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|
|
|
|
|
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0.2 |
1.49 |
1.355 |
0.071 |
5 |
3/3 |
90.9 |
|
0.8 |
2.09 |
1.843 |
0.118 |
6 |
3/3 |
88.2 |
|
2 |
3.29 |
3.287 |
0.319 |
10 |
3/3 |
99.9 |
|
6 |
7.29 |
7.701 |
0.478 |
6 |
3/3 |
105.6 |
β淀粉樣1-40肽
|
過量加標濃度
ng/mL |
質控品濃度 |
平均計算濃度 |
標準偏差 |
% CV |
重復檢測的合格次數 |
平均準確度 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.2 |
2.75 |
2.359 |
0.015 |
1 |
2/3 |
85.8 |
|
0.8 |
3.35 |
3.054 |
0.016 |
1 |
2/3 |
91.2 |
|
2 |
4.55 |
3.929 |
0.011 |
0 |
3/3 |
86.4 |
|
6 |
8.55 |
8.209 |
0.5 |
6 |
3/3 |
96 |
β淀粉樣1-42肽
|
過量加標濃度
ng/mL |
質控品濃度 |
平均計算濃度 |
標準差 |
% CV |
重復檢測的合格次數 |
平均準確度 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.2 |
0.663 |
0.655 |
0.07 |
11 |
3/3 |
98.8 |
|
0.8 |
1.263 |
1.145 |
0.058 |
5 |
3/3 |
90.7 |
|
2 |
2.463 |
2.403 |
0.121 |
5 |
3/3 |
97.5 |
|
6 |
6.463 |
5.986 |
0.701 |
12 |
3/3 |
92.6 |
表3：對用3種人源混合腦脊液制備出的質控樣品所進行分析的典型結果
結論
1. 我們開發了一種用于同步定量分析人和猴腦脊液中多種β淀粉樣肽的SPE-LC/MS/MS生物分析方法并對其進行了驗證。
2. 將基于µElution型混合模式SPE的高選擇性萃取方法與UPLC色譜分析的分辨率相結合是實現對人和猴腦脊液中3種主要β淀粉樣肽進行準確、精確而可靠的定量分析的關鍵。
3. 正離子MS/MS和b離子序列碎片的使用提供了本應用所需的質譜特異度。
4. 用不到30分鐘的時間即可完成對96份樣品的萃取并作好進樣準備，從而滿足了臨床前研究所需的樣品制備處理通量要求。
5. 本文所述的方法避免了在臨床前研究工作中進行耗時的免疫測定或免疫沉淀步驟。
6. Xevo TQ質譜的質量范圍和靈敏度允許選擇高m/z前體進行破碎并能選擇特異度高的b離子碎片，從而增加了此項測定的信噪比并總體提高了其特異度。
7. 此類方法也可允許選擇性的、特異性的、并按高通量方式同時測定一份樣品中的幾種不同β淀粉樣肽，而同時仍能達到低濃度內源性β淀粉樣肽分析所需的高靈敏度。這是一個明顯的優點，因為ELISA測定需要使用多種抗體進行多次測定。
所選擇的參考文獻
1. T.A. Lanz、J.B. Schachter．神經科學方法雜志，169 (2008) 16-22.
2. T. Oe等．質譜分析中的快速通訊，20 (2006) 3723-3735.
3. JR Slemmon等．色譜分析雜志：生物分析，846 (2007) 24-31.
4. NT Ditto等．神經科學方法雜志，182 (2009) 260-265.
5. T.A. Lanz、J.B. Schachter．神經科學方法雜志，157 (2006) 71-81.
6. MJ Ford等．神經科學方法雜志，168 (2008) 465-474.
7. E. Portelius等．蛋白質組學研究雜志，6 (2007) 4433-4439.
致謝
本文作者希望向Wenlin Li（輝瑞公司PDM部）表達謝意，感謝她在使用免疫親和LC/MS/MS分析β淀粉樣肽所作的前期工作。
沃特世公司
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