Adawarbler全胚胎旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展

體外全胚胎培養(yǎng)技術(shù) ( whole  embryo  culture, WEC) 是一種將動(dòng)物的完整胚胎移植到體外進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。也越來(lái)越受到科學(xué)家的重視和深入研究。 

        Nicholas于1934年采用血漿作為培養(yǎng)基, 證明大鼠胚胎能夠在母體外培養(yǎng)成活 24~36h, 從而創(chuàng)立了該實(shí)驗(yàn)方法。之后, 科學(xué)家們對(duì)培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法等條件不斷改善。20世紀(jì) 80年代, Brown制定了用于評(píng)價(jià)胚胎的生長(zhǎng)和分化情況的評(píng)分系統(tǒng), 作為評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育程度的指標(biāo)。 目前, WEC已經(jīng)被廣泛用于胚胎發(fā)育、化合物的胚胎毒性和致畸性研究以及藥物的安全評(píng)價(jià)等 。能夠用于WEC 的胚胎材料來(lái)源廣泛, 魚(yú)類、兩棲類、鳥(niǎo)類、哺乳類胚胎均可用于實(shí)驗(yàn)。
      采用上述動(dòng)物胚胎進(jìn)行的各種研究均已見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道, 例如, 朱小山、端正花等應(yīng)用斑馬魚(yú)胚胎分別研究了富勒烯和雙酚 A 的胚胎毒性;  L i X Y 等應(yīng)用蛙卵研究了1甲基 3 辛烷基咪唑啉酮溴化物對(duì)胚胎發(fā)育的影響; Alva rezl等應(yīng)用雞胚胎研究了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ( FGFs) 的神經(jīng)誘導(dǎo)作用; Hansen JM 等采用兔胚胎與大鼠胚胎對(duì)比研究了谷胱甘肽和半胱氨酸在反應(yīng)停致畸中的作用等。目前, 利用大鼠或小鼠器官形成期的胚胎通過(guò)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)方法進(jìn)行化合物的致畸研究最為常見(jiàn)。

1.WEC 技術(shù)及其發(fā)展概況

1.1培養(yǎng)方法 

         全胚胎培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)歷了從靜態(tài)培養(yǎng)向旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)發(fā)展的過(guò)程。20世紀(jì) 30 年代, Nicholas等建立了早期的體外靜態(tài)胚胎培養(yǎng)技術(shù)。以大鼠肝素化血清與大鼠14~15d的胚胎提取物混合作為培養(yǎng)基, 可使得大鼠胚胎在體外生長(zhǎng)。然而, 胚胎生長(zhǎng)的時(shí)間較短, 一般在培養(yǎng)的 24 h內(nèi)生長(zhǎng), 而36h后胚胎生長(zhǎng)速度即減慢。培養(yǎng)48h內(nèi)正常生長(zhǎng)的胚胎不到一半, 正常分化的胚胎只有3/4。

        New等通過(guò)靜態(tài)培養(yǎng)法, 以血漿凝塊作為培養(yǎng)基, 并在培養(yǎng)過(guò)程中通入4%-5%CO2氣體, 有效地提高了體節(jié)階段早期胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育率。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn), 通入60%的O2氣體對(duì)于胎齡較長(zhǎng)的胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育率有提高作用。在此之后, New對(duì)其技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn), 其設(shè)計(jì)的循環(huán)器裝置采用循環(huán)的同源離心血清培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎培養(yǎng), 在培養(yǎng)過(guò)程中通入95% O2和5% CO2氣體。結(jié)果證明, 除在30體節(jié)胚胎無(wú)法建立血管與尿囊胎盤(pán)的連接外, 胚胎生長(zhǎng)發(fā)育和器官分化均與體內(nèi)同齡胚胎無(wú)顯著性差異。

        由于循環(huán)器裝置較復(fù)雜, New等隨后又設(shè)計(jì)了一套更為簡(jiǎn)便的充氣旋轉(zhuǎn)瓶裝置, 采用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法, 其培養(yǎng)效果與循環(huán)培養(yǎng)器裝置的培養(yǎng)基本一致。目前所采用的WEC技術(shù)基本上是在New的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái), 即采用大鼠或小鼠受孕后8-10d的全胚胎,在合適的氣體環(huán)境和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基條件下, 進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)一定時(shí)間后, 根據(jù)研究目的進(jìn)行全胚胎評(píng)價(jià)。

1.2 培養(yǎng)工具

        Adawarbler® WEC001-GT系列是一款基于New等科學(xué)家當(dāng)初的充氣旋轉(zhuǎn)瓶裝置原理再次創(chuàng)新的革命性的AI智能精密型全胚胎旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)突破了傳統(tǒng)靜態(tài)或簡(jiǎn)單懸浮培養(yǎng)胚胎的局限，集成了 Gastri3 AI三氣智能分配管理系統(tǒng)、高精度壓力控制模塊及EmbyroLive20 遠(yuǎn)程攝像模塊。它專為高度模擬體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境而設(shè)計(jì)，至少支持全胚胎或類器官?gòu)腅0到E90的長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于：

• 嚙齒動(dòng)物全胚胎培養(yǎng) (WEC)
• 類胚胎 (Embryoids) 與類囊胚 (Blastoids) 構(gòu)建
• 人/鼠類器官 (Organoids) 的長(zhǎng)期分化與發(fā)育

• iPSC (誘導(dǎo)多能干細(xì)胞) 的動(dòng)態(tài)擴(kuò)增

       系統(tǒng)技術(shù)原理：該裝置是DAT New和DL Cockroft Experientia 35,138(1979)描述的充氣旋轉(zhuǎn)瓶裝置(當(dāng)時(shí)領(lǐng)域內(nèi)首創(chuàng))的現(xiàn)代化改進(jìn)版本，每個(gè)培養(yǎng)瓶都具有封閉獨(dú)立的微環(huán)境，并且經(jīng)過(guò)技術(shù)工程師二次創(chuàng)新設(shè)計(jì)成完全適合小鼠等全胚胎等組織培養(yǎng)的可穩(wěn)定長(zhǎng)期發(fā)育的精密培養(yǎng)系統(tǒng)。具體的培養(yǎng)方法已經(jīng)預(yù)設(shè)在系統(tǒng)內(nèi)。本裝置中的培養(yǎng)小瓶也同樣基于其經(jīng)典的"British Turntable Culture (BTC)"標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行了現(xiàn)代化制造：

1. 動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)： 通過(guò)DishKP系列可插拔單軸回轉(zhuǎn)器（20孔位），帶動(dòng)薄壁（1000μm）培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)，確保持續(xù)的高效率的營(yíng)養(yǎng)交換和氣體平衡，幾乎無(wú)體內(nèi)流體剪切力，保壓且可自由插拔，更適合高通量培養(yǎng)。
2. 精密控氣： 內(nèi)置 AI 算法實(shí)時(shí)調(diào)控CO2、O2、N2的體積（%vol）或質(zhì)量（%wt）比例，支持低氧（Hypoxia）及高氧（Hyperoxia）培養(yǎng)，無(wú)需人工干預(yù)。
3. 微正壓環(huán)境： 創(chuàng)造高于大氣壓的微正壓環(huán)境（0.0-20.0PSI），并且可以自由控制，非常準(zhǔn)確的模擬胚胎或器官發(fā)育過(guò)程中的體內(nèi)生理壓力環(huán)境。

               
                                 圖1：現(xiàn)代化改造高通量的金屬分氣旋轉(zhuǎn)盤(pán)DishKP

1.3培養(yǎng)基和氣體條件

         培養(yǎng)基作為WEC成功與否的關(guān)鍵, 長(zhǎng)期以來(lái)一直是學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)。Nicholas等早期采用雞血漿、淀粉瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胎盤(pán)提取物、瓊脂+不同濃度鹽溶液、雞血漿+大鼠胚胎提取物作為培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎培養(yǎng), 均未取得滿意結(jié)果。New等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明同種血清是大鼠胚胎體外培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基, 且培養(yǎng)效果與提供血清的大鼠性別、是否懷孕、是否與提供胚胎的大鼠為同一只等因素?zé)o關(guān)。近年來(lái), 一些國(guó)內(nèi)學(xué)者也對(duì)WEC的培養(yǎng)基進(jìn)行了進(jìn)一步探索。張?zhí)鞂毜韧ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 用人工合成培養(yǎng)基全部和部分替代大鼠血清進(jìn)行全胚胎培養(yǎng), 結(jié)果發(fā)現(xiàn) TC 199培養(yǎng)基在添加 60%大鼠血清后可替代大鼠血清作為培養(yǎng)基進(jìn)行全胚胎培養(yǎng)。單用小牛血清及用小牛血清+10% 大鼠血清作為培養(yǎng)基, 胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育都不能達(dá)到純大鼠血清的水平。王秋楓等以90%人血清+10%大鼠血清進(jìn)行全胚胎培養(yǎng), 除胚胎 DNA 含量外,其他各項(xiàng)生長(zhǎng)分化指標(biāo)與大鼠血清培養(yǎng)的胚胎無(wú)明顯差異,可以作為替代培養(yǎng)基用于胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育的研究和評(píng)價(jià)。

         目前用于WEC最常用的培養(yǎng)基為同源即刻離心血清 (immediately centrifugal serum,ICS), 即用于大鼠WEC的培養(yǎng)基為成年健康大鼠麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈快速抽血、立即離心后而分離的血清。

        氣體環(huán)境是決定 W EC培養(yǎng)效果的另一重要因素。New等發(fā)現(xiàn),在氣體系統(tǒng)中加入5% CO2能夠起到中和碳酸氫鹽,維持培養(yǎng)基pH的作用, 有益于胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。氧在哺乳動(dòng)物胚胎器官發(fā)育期的代謝過(guò)程中起到重要作用, 合適的氧濃度是WEC成功與否的關(guān)鍵。氧濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致氧化,氧濃度過(guò)低則會(huì)造成代謝性應(yīng)激。New等在確定CO2氣體含量后, 又將O2限定到 20% -95%,觀察胚胎發(fā)育情況,發(fā)現(xiàn)隨著胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行, 耗氧量將會(huì)增加。

       目前廣泛應(yīng)用的WEC氣體系統(tǒng)是由O2,CO2,N2 三種氣體組成。分別于培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)、第 16小時(shí),第26小時(shí)往培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)通入混合氣體, 其比例變化依次O2:CO2:N2(5:5:90,20:5:75,40:5:55)。

       以上培養(yǎng)條件已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化更改比例，內(nèi)置在了Gastri3三氣管理系統(tǒng)中，更方便使用人。                                           

                                          圖2：自動(dòng)化無(wú)人干預(yù)執(zhí)行的Gastri3 AI三氣管理系統(tǒng)

      關(guān)于WEC培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題、WEC技術(shù)在生長(zhǎng)發(fā)育和毒理學(xué)中的應(yīng)用參考下一章節(jié)。