實驗方法分享：基于圖像表型分析方法評估大麥對水淹脅迫的響應與恢復

方法來源
Langan, P. et al. Evaluating waterlogging stress response and recovery in barley (Hordeum vulgare L.): an image-based phenotyping approach. Plant Methods 20, 146 (2024).
 
研究單位

• 愛爾蘭都柏林大學
• 法國亞眠大學

 
關鍵儀器裝備
PlantScreen溫室高通量植物表型成像分析系統
 
      PlantScreen溫室高通量植物表型成像分析系統是植物科學研究全面、自動化、高通量的表型解決方案，能夠對從模式植物擬南芥到小麥、玉米等作物的全方位表型性狀進行長期、無損的監測與分析。
      系統分布于世界各大洲的頂尖科研機構、大學及知名農業企業。如荷蘭植物生態表型中心/荷蘭瓦格寧根大學（注：鏈接為專題報道，下同）、德國萊布尼茨植物遺傳和作物研究所（IPK）、芬蘭赫爾辛基大學、澳大利亞國立大學、中國農科院生物技術研究所、中國水稻所等全球知名的農業學府和頂級研究機構，以及杜邦先鋒、孟山都、巴斯夫等農業巨頭公司。  
研究背景
      隨著氣候變化，許多地區的降雨頻率增加，水淹脅迫成為影響大麥產量的一個重要限制因素。水淹脅迫對作物產量的影響因作物種類、管理措施、遺傳多樣性以及脅迫條件而異。水淹會導致土壤中氧氣不足，從而影響植物的生長和發育。大麥是全球第四大作物，對水淹脅迫較為敏感。以往的研究中，水淹脅迫的處理方法和持續時間各不相同，這使得不同研究之間的結果難以比較。因此，本研究旨在通過圖像表型分析方法，確定一個最佳的模擬水淹脅迫的持續時間和設置，以便在控制條件下評估大麥的水淹耐受性。
 
研究目的
      本研究的主要目的是確定一個最佳的水淹脅迫實驗方案，以便在控制條件下評估大麥的水淹耐受性，同時通過圖像表型分析方法來量化水淹脅迫對大麥生長和綠色度的影響。
 
研究方法

• 實驗設計

      實驗分為兩個部分，分別在愛爾蘭都柏林大學和法國亞眠大學進行。選取了四種兩行春大麥品種，包括兩種商業品種（RGT Planet和Concerto）和兩種傳統品種（Glasnevin no.5和Golden Promise）。實驗1在都柏林大學進行，測試了兩種品種（RGT Planet與Glasnevin no.5）、六種不同的水淹脅迫持續時間和恢復時間組合，包括5天、10天和14天的脅迫，以及有無7天恢復期。實驗2在法國亞眠大學進行，驗證了實驗1中選定的最佳方案（14天脅迫加7天恢復）的可重復性，并增加了兩種品種和樣本數量（重復數量從5個增加至10個）。

• 脅迫處理

      在三葉期（即Zadoks 13）對大麥施加水淹脅迫，通過將花盆置于一個密封排水孔的外盆中，使水位保持在土壤表面以上約1厘米處，對應于大約120%的田間持水量。對照組的花盆排水孔未密封，保持在大約60%的田間持水量。在實驗2中，水位保持在大約140%的田間持水量，對照組保持在大約100%的田間持水量。不同水分處理通過PlantScreen™高精度自動灌溉系統每日08:30監測并調控，系統以目標重量為基準實現定量補水。

• 圖像表型分析

      使用PlantScreen™成像平臺，每天從頂部和側面拍攝RGB圖像，以量化水淹脅迫對生長和綠色度的生理影響。通過圖像分析軟件PlantScreen™ Analyzer計算地上部投影面積（PSA，側視與俯視分割像素之和），以評估植物的生長情況。此外，在實驗2中，還進行了FluorCam動態葉綠素熒光成像，以評估植物的光合性能。

• 根系成像和破壞性表型分析

      在實驗1的每個處理結束時，對根系進行手工清洗，并記錄根長和干質量。使用EPSON平板掃描儀和RhizoVision Explorer軟件獲取根系參數，包括長度、體積、直徑和表面積。在成像最后一天，測定地上部莖長、鮮重與干重。實驗2中，在成像最后一天測定了地上部干重。
 
研究結果

• 最佳脅迫方案的確定

      實驗結果顯示，隨著水淹脅迫時間的延長，植物生長的減緩更加明顯，并且這種影響在恢復期仍然持續。在實驗1中，只有14天的脅迫（P5和P6）顯示出對照組和水淹組之間實際干質量的顯著差異（圖3右E和F）。特別是包含7天恢復期的最長處理（P6）在收獲時干質量的變化最為顯著，且通過地上部投影面積PSA（指示地上部生物量）最能清晰區分基因型間的耐受差異（圖3左F），因此被選為后續實驗的最佳處理方案。

• 水淹對大麥生物量和光合性能的影響

      在實驗2中，四種大麥品種在水淹脅迫下的生物量顯著減少，與對照組相比，水淹組的干質量減少了約73%至81%。通過圖像分析，觀察到水淹脅迫下植物的PSA顯著降低，表明生長受到抑制（圖4A）。
      葉綠素熒光成像顯示，在脅迫期間，所有品種的Fv/Fm值（最大光化學效率）都有所降低，但在恢復期有所回升。特別是Golden Promise品種在整個實驗過程中Fv/Fm值的降低幅度最小，顯示出其對水淹脅迫的耐受性（圖4B）。

• 綠色度變化分析

      通過對圖像中的綠色度進行分析，發現水淹脅迫導致某些特定色調的像素數量發生變化。具體來說，較深的綠色調（Hue 2、3和4）在水淹植物中變得不那么明顯，而較淺的綠色調（Hue 7、8、9和10）以及最深的色調（Hue 1）在水淹脅迫下有所增加。這些變化在脅迫期間最為顯著，并在恢復期逐漸恢復正常（圖5）。因此，不同基因型大麥在水淹脅迫下葉片綠色色調的組成和動態變化存在顯著差異，可作為快速、無損的耐淹性診斷指標。 研究結論
      本研究通過圖像表型分析方法，確定了一個最佳的水淹脅迫實驗方案（14天脅迫加7天恢復），該方案能夠顯著區分不同大麥品種對水淹脅迫的響應。研究結果表明，水淹脅迫顯著降低了大麥的生物量和光合性能，并且通過綠色度分析可以觀察到植物對脅迫的適應和恢復能力。此外，本研究還強調了在脅迫后包括恢復期的重要性，因為這有助于觀察植物在脅迫后的生長恢復情況。通過高通量圖像表型分析，本研究提供了一種新的、可重復的評估大麥早期水淹耐受性的方法，有助于更精確地量化與水淹脅迫相關的標記，如綠色度、Fv/Fm和PSA。
 
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