酶聯免疫吸附測定（ELISA）技術的基本原理、類型方法與操作流程
一、技術概述與基本原理
酶聯免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一種將可溶性抗原或抗體固定于固相載體表面，利用其特異性結合反應，并通過酶標記物催化底物顯色進行定性或定量分析的高靈敏度檢測技術。
其核心原理基于三個關鍵步驟：
固相包被：使抗原或抗體牢固吸附于固相載體（如聚苯乙烯微孔板），并保持其免疫活性。
酶標記與特異性結合：使抗原或抗體與特定的酶（如辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP）共價連接，形成酶標結合物。該結合物既能與相應的抗體或抗原發生免疫反應，又保留酶的催化活性。
顯色與定量：在反應體系中，結合在固相上的酶量與樣本中待測物含量成比例。加入酶底物后，底物被催化生成有色產物，通過測定吸光度值即可實現對目標物的精確定量。酶的高效催化作用可極大放大信號，使該方法具備極高的檢測靈敏度。
二、ELISA主要類型及其方法學特點
根據實驗設計，ELISA可分為以下幾種主要類型：
1、直接法
流程：將抗原固定于固相載體，直接加入酶標一抗進行檢測。
優點：操作步驟少，耗時短，避免了二抗可能引起的交叉反應。
缺點：信號無放大作用導致靈敏度較低；每種待測物均需制備特異性酶標抗體，靈活性差；易因非特異性吸附導致背景較高。
2、間接法
流程：將抗原固定于固相載體，依次加入非酶標一抗和酶標二抗進行檢測。
優點：通過二抗放大信號，靈敏度顯著高于直接法；一種酶標二抗可適用于多種同種屬來源的一抗，經濟且靈活。
缺點：實驗步驟增多，周期延長；二抗可能與固相抗原發生非特異性結合，潛在交叉反應風險。
3、雙抗體夾心法
流程：使用兩種分別針對目標抗原不同表位的抗體，一種作為“捕獲抗體”包被固相，另一種作為“檢測抗體”進行檢測（可直接酶標記或通過酶標二間接檢測）。
優點：適用于多表位抗原檢測，具有極高的特異性和靈敏度，是應用最廣泛的ELISA形式。
缺點：要求兩種抗體不存在交叉反應，且不競爭同一結合位點，對抗體配對要求高。
4、競爭法
流程：樣本中的待測抗原（或抗體）與已知量的酶標抗原（或抗體）競爭結合有限量的固相抗體（或抗原）。顯色強度與待測物濃度成反比。
優點：適用于小分子抗原或半抗原的檢測，對樣本純度要求相對較低，數據再現性好。
缺點：操作相對復雜，靈敏度和特異性通常低于夾心法。
三、核心實驗材料與試劑
1、抗原與抗體
抗原：包括天然提純抗原、重組抗原和合成多肽抗原。要求純度高、免疫原性好。
抗體：可采用多克隆抗體或單克隆抗體。用于包被或標記的抗體需具備高純度、高效價和高親和力。
2、固相載體
最常用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的96孔板。要求吸附性能均一、空白值低、透光性好。使用前需進行性能校驗。
3、酶與底物系統
辣根過氧化物酶（HRP）：最常用。常用底物包括OPD（靈敏度高，有潛在致癌性）、TMB（無致癌性，應用廣泛）和ABTS（空白值低）。
堿性磷酸酶（AP）：常用底物為p-NPP。其靈敏度可能高于HRP系統，但制備成本較高，穩定性略差。
選擇依據：酶的催化效率、底物特性、安全性及成本。
4、酶標結合物的制備
常用方法包括戊二醛交聯法（一步法或二步法）和過碘酸鈉氧化法（主要用于HRP）。制備的結合物需純化以去除未結合的酶和抗體，減少背景干擾。
5、包被與封閉
包被：將抗原或抗體吸附于固相載體，通常使用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液，4℃過夜孵育。
封閉：使用1%-5%牛血清白蛋白（BSA）或其它惰性蛋白質溶液封閉未被占據的固相表面，以防止后續步驟的非特異性吸附，降低本底。
四、樣本的采集、處理與保存
1、常見樣本類型：血清、血漿、細胞培養上清、尿液、腦脊液、組織勻漿液等。
2、采集與預處理：
血清/血漿：避免溶血，充分離心去除纖維蛋白原或細胞成分。
細胞培養上清：離心去除細胞及碎片。
組織樣本：迅速勻漿，離心后取上清檢測。
尿液：使用無菌容器，新鮮采集并及時檢測或保存。
3、保存原則：
短期（數日內）可于2-8℃保存。
長期需分裝后于-20℃或-80℃凍存，并避免反復凍融，以防靶蛋白降解或效價降低。
所有樣本在檢測前應確保澄清、無沉淀。
五、雙抗體夾心法ELISA標準操作流程
以雙抗體夾心法為例，其典型步驟如下：
1、包被：將捕獲抗體稀釋于包被緩沖液中，加入微孔板，4℃過夜孵育。
2、洗滌：棄去孔內液體，使用含吐溫-20的PBS緩沖液（PBST）填充各孔，靜置后棄去，重復3-5次，以去除未結合物質。
3、封閉：加入封閉液（如5% BSA），37℃孵育1-2小時，隨后再次洗滌。
4、加樣與孵育：加入標準品或待測樣本，37℃孵育一定時間，使抗原與捕獲抗體充分結合，隨后洗滌。
5、加檢測抗體：加入酶標記的檢測抗體（或先加未標記檢測抗體，再加酶標二抗），37℃孵育，洗滌。
6、加底物顯色：加入酶促反應底物溶液，避光反應一定時間。
7、終止反應與檢測：加入終止液（如硫酸）終止反應，立即于特定波長下（如TMB為450nm）測定各孔吸光度（OD值）。
8、數據分析：繪制標準曲線，計算樣本中待測物濃度。
六、常見問題分析與解決方案
| 問題現象 | 潛在原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 背景信號過高 | 封閉不充分 | 優化封閉液種類、濃度及封閉時間。 |
| 洗滌不徹底 | 確保洗滌液配方正確，增加洗滌次數與浸泡時間。檢查洗板機性能。 | |
| 酶結合物濃度過高 | 進行梯度稀釋，確定最佳工作濃度。 | |
| 底物被污染或曝光 | 底物避光保存，現用現配。 | |
| 樣本或試劑交叉污染 | 使用新吸頭，加樣時避免濺出。 | |
| 標準曲線良好，樣本無信號 | 樣本中無目標物或含量過低 | 設置陽性對照，確認樣本中目標物預期含量。 |
| 樣本中存在基質干擾 | 對樣本進行適當稀釋或透析處理。 | |
| 高劑量Hook效應 | 對樣本進行系列稀釋后復測。 | |
| 重復性差 | 加樣操作誤差 | 校準移液器，確保加樣準確。 |
| 試劑未充分混勻 | 使用前渦旋振蕩或顛倒混勻所有液體試劑。 | |
| 孵育溫度或時間不一致 | 使用穩定的孵育箱，避免疊放板條。 | |
| 微孔板內有氣泡 | 加樣后檢查并挑破氣泡。 | |
| 假陽性結果 | 非特異性交叉反應 | 驗證抗體特異性，優化抗體濃度。 |
| 洗滌不充分（殘留未結合物） | 嚴格執行洗滌程序。 | |
| 樣本中含有內源性過氧化物酶（如溶血） | 在HRP系統中，可加入過氧化氫酶抑制劑或選用AP系統。 |
七、試劑盒選擇要點
特異性：優選采用經嚴格驗證的、高特異性的抗體對（尤其是雙單抗配對）。
靈敏度：根據樣本中待測物的預估濃度范圍，選擇檢測下限合適的試劑盒。
重復性：評估試劑盒的板內與板間變異系數（CV），通常應小于15%。
簡便性與通量：考慮操作步驟的繁簡、孵育時間長短以及是否適用于自動化平臺。
八、ELISA技術相關技術服務哪里有？
樂備實（LabEx）提供ELISA技術相關技術服務
| 技術名稱 | 技術類型 | 技術優勢 | 檢測原理 | 應用領域 |
|---|---|---|---|---|
| 酶聯免疫吸附（ELISA） | 1. 雙抗體夾心法（檢測大分子抗原）；
|
1. 高特異性：依賴抗原 - 抗體特異性結合，交叉反應低；
|
1. 雙抗體夾心法：包被抗體結合樣本中抗原→加入檢測抗體形成復合物→酶標試劑結合檢測抗體→底物顯色，吸光度與抗原濃度正相關；
|
1. 基礎科研：蛋白表達定量、抗體水平檢測、病原體篩查；
|
樂備實是國內專注于提供高質量蛋白檢測以及組學分析服務的實驗服務專家，自2018年成立以來，樂備實不斷尋求突破，公司的服務技術平臺已擴展到單細胞測序、空間多組學、流式檢測、超敏電化學發光、Luminex多因子檢測、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學等30多個，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細胞以及組織水平實驗的完整檢測體系。
原文點擊：酶聯免疫吸附測定（ELISA）技術：原理、方法與問題解析
